非小细胞肺癌患者血清外泌体c-myc mRNA表达及预后关系

张石丰，楚玉洁，余耀华

(郑州市中心医院呼吸与危重症医学科,河南 郑州 450000)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占全部肺癌的80 %，具有发病率、病死率高的特点[1]。当前NSCLC治疗涉及手术、放化疗、免疫疗法、靶向治疗等多种方式，虽较以往提高了NSCLC疗效，但患者整体远期预后仍不理想[2]。预后评估影响着NSCLC患者治疗期间方案调整，但目前临床尚缺乏敏感、可靠的预后评估指标[3]。外泌体是广泛存在于体液中、可由多数细胞分泌的一种细胞外囊泡，其含有蛋白质、微小RNA、信使RNA(mRNA)等多种生物活性分子，被认为生物学效应广泛，与肿瘤发生发展关系密切[4]。c-myc作为一种定位于染色体8q24.1的原癌基因，可经染色体扩增、易位、重排而激活，其编码的蛋白质可参与细胞增殖、分化等调节，可在肿瘤细胞中呈高表达状态[5]。当前关于c-myc的液体检测并不多见，本研究通过分析NSCLC患者血清外泌体c-myc mRNA表达及与临床特征、预后关系，旨在为NSCLC预后评估提供参考。

1 对象与方法

1.1一般资料 选取2017年1月-2019年3月胸外科收治的105例NSCLC患者，作为肺癌组。纳入标准：首次经病理活检明确NSCLC诊断；入组前未接受相关治疗；意识清楚、认知正常；自愿配合治疗及研究；签署知情同意。排除标准：排除肺癌外其他原发性肿瘤；合并心功能不全、肝肾疾病、胃肠道疾病、感染性疾病等；正在参与其他研究；妊娠或哺乳期女性。105例NSCLC患者，男/女(62/43)例，年龄41～75(59.06 ± 10.76)岁，肿瘤直径<3 cm/≥3 cm(51/54)例，病理类型：鳞癌/腺癌/其他(49/44/12)例，分化程度：低分化/中分化 /高分化(29/51/25)例，临床分期：Ⅰ期/Ⅱ期/Ⅲ期/Ⅳ期(25/38/31/11)例，吸烟者(每天吸烟≥1支，连续或累计时间≥6个月)68例。另选取同期良性肺疾病(良性组)、健康体检者(健康组)各60例，良性组男/女(37/23)例，年龄40～75(57.68±11.04)岁，其中急性肺炎20例、肺结核21例、慢阻肺19例，吸烟者36例；健康组男/女(33/27)例，年龄36～78(58.04 ± 12.16)岁，吸烟者34例。三组性别、年龄、吸烟率比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会批准(201701012)。

1.2检测方法

1.2.1外泌体提取 采集外周静脉血5 mL，常温静置30 min，离心取上清液1 mL，(离心条件：温度4 ℃，转速3000 rpm，半径20 cm，时间10 min)，加入1.5 mL EP管，于-80 ℃保存，一周内待测；通过差异超速离心法(Beckman L-80XP，SW28Ti水平转子)提取血清外泌体。主要步骤如表1。

表1 差异超速离心法提取血清外泌体步骤

1.2.2外泌体鉴定

1.2.2.1透射电镜法：取外泌体溶液20 μL，加入1×PBS 20 μL稀释后，稀释液滴加到载样铜网(100目)，静置1 min，滴加20 μL 3 %磷钨酸钠溶液到铜网，负染1 min，滤纸将多余液体吸去，在透射电镜下抽真空后观察外泌体形态。

1.2.2.2蛋白免疫印迹法(western blot)：主要步骤如表2。

表2 蛋白免疫印迹法鉴定外泌体步骤

1.2.3外泌体RNA提取 从外泌体样本中提取RNA(QIAzol Lysis试剂，上海科敏生物科技有限公司)，利用超微量分光光度计(型号：NanoDrop 2000，北京金业德祥科技有限公司)检测RNA浓度；通过逆转录技术获得逆转录产物cDNA[内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)及c-myc引物：上海生工生物工程有限公司]；实时荧光定量PCR(PCR仪型号：美国ABI QuantStudio 5型，qRT-PCR试剂盒：南京诺唯赞生物科技有限公司)检测c-myc mRNA表达量；采用琼脂糖凝胶电泳进行目的基因鉴定；采用2-△△ct法定量计数mRNA相对于内参GAPDH表达量。

1.3观察指标 (1)比较肺癌组、良性组、健康组血清外泌体c-myc mRNA表达情况；(2)分析不同临床特征(性别、年龄、肿瘤直径、病理类型、分化程度、临床分期、吸烟状态)NSCLC患者泌体c-myc mRNA表达水平；(3)参照《实体瘤疗效评价标准》[6]，对比不同疗效患者治疗前后血清外泌体c-myc mRNA表达水平；治疗原则：有手术指征先行手术治疗，术后参照指南[7]规范辅助放化疗，无手术指征者参照指南制定个性化方案。(4)所有患者随访2年，每2个月复查1次，以2021年4月30日为随访截止时间，统计患者无进展生存情况；绘制生存分析曲线比较血清外泌体c-myc mRNA高表达组与低表达组2年无进展生存率。C-myc mRNA表达定义：以ROC曲线中约登指数最大时对应值为临界值，小于临界值视为低表达，大于临界值为高表达。

2 结果

2.1血清外泌体鉴定 外泌体提取后，先采用透射电镜鉴定外泌体形态，可见具有脂质双层囊膜、大小50 ～ 100 nm的圆形颗粒(左)；采用western blot法对外泌体标记进行蛋白鉴定，结果提示存在CD63、TSG101表达(右)(图1)。

图1 5万倍透射电镜下外泌体形态图(左)及western blot法鉴定结果(右，1、2、3对应三位患者)

2.2肺癌组、良性组、健康组血清外泌体c-myc mRNA表达比较 三组血清外泌体c-myc mRNA表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，且肺癌组血清外泌体c-myc mRNA表达水平显著高于良性组、健康组(P<0.05)，但良性组与健康组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 肺癌组、良性组、健康组血清外泌体c-myc mRNA表达比较

2.3不同临床特征血清外泌体c-myc mRNA表达情况 临床分期Ⅲ期、Ⅳ期者血清外泌体c-myc mRNA表达水平显著高于I期、Ⅱ期者(P<0.05)，吸烟者血清外泌体c-myc mRNA表达水平显著高于非吸烟者(P<0.05)；血清外泌体c-myc mRNA表达水平与性别、年龄、肿瘤直径、病理类型、分化程度无关(P>0.05)。见表4。

表4 不同临床特征血清外泌体c-myc mRNA表达情况

2.4不同疗效患者治疗前、治疗后血清外泌体c-myc mRNA表达 经规范治疗后，105例NSCLC患者12例达到完全缓解(CR)，41例达到部分缓解(PR)，32例达到稳定(SD)，20例发生疾病进展(PD)；治疗后，CR、PR组c-myc mRNA表达水平显著低于治疗前(P<0.05)，但SD、PD组c-myc mRNA表达水平与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)；CR、PR、SD、PD四组治疗前、治疗后血清外泌体c-myc mRNA表达水平均有差异，且均表现为CR组 < PR组 < SD组 < PD组(P<0.05)。见表5。

表5 不同疗效患者治疗前、治疗后血清外泌体c-myc mRNA表达

2.5血清外泌体c-myc mRNA表达水平的预后意义分析 经ROC曲线分析，约登指数指数最大值为0.710，此时对应血清外泌体c-myc mRNA临界值为0.0468(图2)，以c-myc mRNA≥0.0468为高表达组，共78例，c-myc mRNA < 0.0468为低表达组，共27例。105例患者无失访，37例未见复发转移，无进展生存率为35.24 %，其中c-myc mRNA低表达组无进展生存期4 ～ 24个月，M(P25，P75)= 24(12，24)，2年无进展生存有14例(51.85 %)；c-myc mRNA高表达组无进展生存期3 ～ 24个月，M(P25，P75)= 10(7，24)，2年无进展生存有23例(29.49 %)；生存曲线结果显示，c-myc mRNA低表达组无进展生存率显著高于c-myc mRNA高表达组(log-rank χ2= 6.828，P=0.009)(图3)。

图2 血清外泌体c-myc mRNA诊断NSCLC的ROC曲线

图3 NSCLC患者血清外泌体c-myc mRNA低表达组、高表达组生存曲线

3 讨论

NSCLC因发病隐匿性，75 %左右患者就诊时已处于中晚期，患者整体5年生存率仅在16 %～18 %[8]。疾病进展及复发转移是NSCLC治疗面临的最主要挑战，也是患者预后不良的直接原因，寻找有效的标志物监测疾病进展、调整治疗方案对改善患者预后有积极意义[9]。近年来，液体活检因其精准性、非侵入性、可实时监测等优势，成为肿瘤诊断、预后评估和治疗的研究热点[10]。既往有报道[11]认为循环肿瘤细胞对NSCLC术后复发转移有预测价值，但循环肿瘤细胞富集是临床一大难点，存在较高的假阴性结果；也有研究[12]指出循环肿瘤DNA有助于评价NSCLC治疗效果，但其水平受清除速度、血容量等因素影响较大。

外泌体在液体活检中具有独特优势：其一，外泌体存在于血液、尿液、脑脊液、胸腔积液等多种体液中，其来源采集容易；其二，外泌体携带大量本源细胞蛋白质、DNA、RNA等多种生物活性成分，能反映本源细胞的病理生理状态，对疾病诊断、进展具有启示作用；其三，外泌体的脂质双层膜能保护内部核酸、蛋白质免于各种酶类降解，相比循环中游离的核酸、蛋白质等稳定性好，结果更可靠[13]。虽然当前关于外泌体来源mRNA相较外泌体来源蛋白质、miRNA在恶性肿瘤中的报道少，但其与肿瘤的关系已得到重视。胡慧珍等[14]报道，口腔鳞状细胞癌癌细胞外泌体mRNA表达谱与正常上皮细胞表达谱差异巨大，该研究认为外泌体mRNA与肿瘤发生、发展及转移可能密切相关。许乘凤等[15]报道指出，乳腺癌可通过外泌体携带mRNA形式传递耐药信息，是导致乳腺癌化疗失败的重要原因。Provencio等[16]研究发现，在非霍奇金B细胞淋巴瘤预后监测中，以血浆外泌体BCL-6 mRNA、c-myc mRNA等为生物标记物行液体活检具有重要价值。这些研究表明，检测外泌体mRNA可了解肿瘤发展、转移、耐药性、预后等重要信息，有助于指导临床监测及治疗。

外泌体mRNA数量、种类众多，本研究关注的c-myc属于myc原癌基因家族，其参与肿瘤发生、增殖、侵袭等过程，在多种恶性肿瘤中表达明显升高[17]。研究显示[18]，NSCLC癌组织c-myc蛋白表达水平显著上升，具有抑制肺癌细胞凋亡、促进肺癌发生发展作用；还有报道指出[19]，相较正常肺组织，肺癌组织c-myc表达水平上升，且与肺癌淋巴转移状态、组织学分级存在关联。但这些研究多基于人体组织、细胞检测，涉及液体检测极少。基于c-myc基因与肺癌发生发展关系密切以及血液循环外泌体可检测到c-myc mRNA，本研究重点监测了NSCLC患者血清外泌体c-myc mRNA的表达。本研究外泌体分离采用的是差异超速离心法，是目前外泌体分离的金标准；鉴定选择的是电镜观察结合western blot标记性检测，是目前外泌体鉴定常用手段[20]。外泌体分离后，经总RNA提取、逆转录、定量PCR等步骤及2-△△ct法计算，可获得外泌体c-myc mRNA相对表达量。

本研究结果显示，肺癌组血清外泌体c-myc mRNA表达水平较良性组、健康组明显升高，提示血清外泌体c-myc mRNA高表达可能参与NSCLC发生。分析血清外泌体c-myc mRNA表达与NSCLC临床特征关系，结果显示，临床分期Ⅲ期、Ⅳ期者其表达水平较I期、Ⅱ期者明显升高，提示血清外泌体c-myc mRNA高表达可能参与NSCLC进展。一直以来，吸烟被视为影响肺癌发生的一项独立危险因素。本研究显示，相较于非吸烟者，血清外泌体c-myc mRNA在吸烟者中表达水平显著升高，推测可能因为香烟中某些成分可通过某种机制激活c-myc表达，但具体机制有待进一步研究。虽然年龄、肿瘤直径、分化程度等可能影响着肺癌发生或预后，但本研究尚未发现这些因素对血清外泌体c-myc mRNA表达水平影响，这可能受研究样本等限制，后期需多中心、多样本进一步观察。

本文结果显示，CR、PR组治疗后血清c-myc mRNA表达水平较治疗前明显降低，但SD、PD组治疗前后表达水平变化不明显，且无论是治疗前还是治疗后，血清外泌体c-myc mRNA表达水平均表现为CR组 < PR组 < SD组 < PD组，提示血清外泌体c-myc mRNA表达水平或许可预测患者治疗效果，可能与血清外泌体c-myc mRNA介导肿瘤细胞耐药性有关，值得临床进一步研究。此外，本研究发现，血清外泌体c-myc mRNA低表达组2年无进展生存率51.85 %，高于高表达组的29.49 %，提示血清外泌体c-myc mRNA表达水平与患者远期预后存在关系。

综上，NSCLC患者血清外泌体c-myc mRNA表达明显升高，且和患者临床分期、疗效及远期预后存在关联，其在NSCLC患者诊断及预后监测中展现出了良好应用前景，值得临床深入探索。