紫糯小麦籽粒石蜡切片制作技术优化及淀粉粒累积分析

刘 娟，夏文荣，李 运，李 妍，朱元刚，戴忠民

(德州学院，山东德州 253023)

小麦(L．)是我国重要的粮食作物之一，其产量和品质直接影响人类食物供应程度和营养水平。淀粉是小麦籽粒的主要组成成分，可分为直链淀粉和支链淀粉，一般胚乳淀粉中含有20%～30%直链淀粉和70%～80%支链淀粉。编码淀粉合成酶(granule bound starch synthase，GBSS)的waxy基因缺失、突变或遗传表达障碍会使胚乳中直链淀粉的含量减少，支链淀粉含量上升，小麦胚乳表现为糯性。小麦籽粒淀粉中直链淀粉含量 1%或不含直链淀粉的小麦称为全糯质小麦。小麦籽粒可分为果皮、珠被、珠心组织、胚乳和胚五部分，其中果皮和胚乳是储存淀粉的主要部位。果皮可分为外果皮、中果皮和内果皮三部分，其中，中果皮薄壁细胞的主要组成成分为淀粉，胚乳细胞可分为糊粉层细胞、胚乳转移细胞和淀粉胚乳细胞三种类型，淀粉胚乳细胞主要含有淀粉和蛋白质。目前，在糯性小麦淀粉粒形态方面，熊 飞等和刘 智等发现，不同小麦品种成熟籽粒胚乳细胞淀粉体均可分为饼形大淀粉体、椭圆形中型淀粉体、圆球形小淀粉体3种类型，且分布存在差异。蔡瑞国等认为，糯性小麦成熟籽粒中存在A型大淀粉粒和B型小淀粉粒；鲁 平等也发现糯性小麦胚乳存在两种淀粉粒形态。但是从整体结构上研究糯性小麦籽粒发育过程中果皮和胚乳淀粉粒积累的研究鲜见报道。

石蜡组织切片在植物组织和结构形态学等研究中广泛应用。传统的石蜡切片制作方法需经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色及封固等多个环节，要制出高质量的切片，每一个步骤的操作都很重要，且对特殊组织材料不能适用，因此需要改进。康海岐等利用PAS(periodie acid-schiff reaction)反应原理，改进了第0～10天的水稻籽粒石蜡切片制作方法。于晓刚等对传统石蜡切片技术中固绿步骤的染色时间进行了研究，发现花后不同天数的粳稻颖果染色最佳时间差异很大。张润琪等主要从酒精氯仿混合透明逐级浸蜡等方面改良了石蜡切片技术；Zhang等开发了一种在小麦籽粒灌浆的中后期(开花后28 d和35 d)获得高质量全组织切片的简单方法；Yu等利用此法比较研究了糯性和非糯性小麦授粉后第8天、第15天、第27天胚乳淀粉的发育情况。尽管前人对小麦籽粒发育的微观结构进行了许多研究，但关于糯性小麦发育前期籽粒的特点尚缺少更加细致地报道。本研究以糯性小麦品种山农紫糯2号为试验材料，对常规石蜡切片制作技术进行改良，并结合光学显微镜对授粉后0～14 d的发育期籽粒淀粉粒的积累进行观察研究，以进一步阐明小麦果皮和胚乳中淀粉粒的发育特征及小麦果皮和胚乳发育的关系，旨在为石蜡切片技术的应用和糯性小麦品质改良提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为山农紫糯2号，于2019年-2020年度种植于山东省德州市农科院试验农场，大田常规水肥管理。开花时，选择开花和生长一致的穗中部1、2位籽粒，采用单株挂牌和记号笔点颖相结合的方式进行标记，分别于开花当天(0 d)和花后2、4、6、8、10、12和14 d采集小麦籽粒，每次至少取10粒。

1.2 材料固定

对发育早期(花后0～6 d)籽粒，直接用2.5%戊二醛固定液固定；对于发育8 d及以后的籽粒，先横切成3段，然后用2.5%戊二醛固定液固定，时间均为24 h以上。

1.3 籽粒形态观察

取花后不同发育天数的小麦籽粒，于体视显微镜(Olympus，SZX10型)下观察并采集照片。

1.4 石蜡切片的制作

试验初期根据传统方法制作石蜡切片，针对出现的问题对小麦籽粒石蜡切片制作过程中的洗脱、透明和浸蜡等环节进行优化。

(1)传统石蜡切片制作方法 脱水程序为：30%乙醇，1 h→50%乙醇，1 h→70%乙醇，1 h→85%乙醇，1 h→90%乙醇，1 h→95%乙醇，1 h→无水乙醇， 3次，每次1 h。透明程序为：无水乙醇∶二甲苯=1∶1→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→二甲苯Ⅲ，各1 h。浸蜡程序为：二甲苯∶石蜡= 1∶1，60 ℃保温12 h；石蜡Ⅰ，60 ℃保温12 h；石蜡Ⅱ，60 ℃保温24 h。

(2)优化方法 脱水程序对70%乙醇和无水乙醇处理进行优化，具体见表1。透明程序借鉴张润琪等的方法。浸蜡方案参考康海岐等的方法设计3种程序，具体见表2。

表1 小麦籽粒不同脱水时间处理Table 1 Treatment of wheat grain with different dehydration time

表2 小麦籽粒不同浸蜡程序Table 2 Different wax soaking procedures of wheat grain

浸蜡后的样品按常规方法包埋成蜡块，然后在石蜡切片机(KD-2508，China)上切成10 μm厚的切片，并转移到粘附载玻片(Citoglas，REF188105W，China)上。常规脱蜡后用0.5%甲苯胺蓝染色10 min和0.5%冰醋酸分色40 s，中性树胶封固后使用光学显微镜(徕卡DMI3000B)观察并采集照片。

2 结果与分析

2.1 籽粒发育过程中的形态变化

小麦籽粒发育初期表面呈乳白色，腹部中央脐部呈现浅绿色，内部含有乳白色浆状物质。发育中期小麦籽粒因果皮中含有叶绿体而呈现绿色。随着发育天数的增加，小麦籽粒体积由小变大，0～6 d体积变化明显，其后逐渐变缓(图1)。

A：背面；B：腹面。图下方数字为小麦籽粒发育天数，标尺=1 mm。

2.2 蜡切片技术优化

根据传统石蜡切片方法制作的小麦籽粒石蜡切片，浸蜡后籽粒变硬且呈现棕黄色，切片时出现粉末且蜡带中间有孔洞，或者可切片但厚度在15 μm以上，切片效果不理想。试验方法改进过程中发现脱水、透明和浸蜡环节对切片质量影响较大，经过不断摸索对梯度脱水时间、透明和浸蜡程序进行了优化。

2.2.1 脱水和透明程序的优化

制片过程中若组织内的水分不能除尽，就会影响后续的透明和浸蜡。发育早期小麦籽粒在固定后，腹侧仍呈现较浅的绿色，与其他组织相比，较易判断脱水的效果。根据设计对70%乙醇和100%乙醇时间进行了优化，发现仅增加70%乙醇处理时间，籽粒绿色不能完全褪去，增加无水乙醇处理时间后，脱水效果较好，绿色褪去，呈现淡黄色。

使用传统方法透明时有的籽粒没有明显变化(图2A)，有的籽粒明显皱缩(图2C)，透明程序结束后籽粒颜色均加深，多呈深黄色(图2B、D)。使用改良的乙醇二甲苯逐级透明方案时，籽粒在透明过程中没有明显变化(图2E)，直至透明结束籽粒仍饱满，呈现更加明显的乳白色或者淡黄色(图2F)。故较优透明程序为乙醇二甲苯逐级透明法，即无水乙醇∶二甲苯=3∶1→无水乙醇∶二甲苯=2∶1→无水乙醇∶二甲苯=1∶1→纯二甲苯，各1 h。

A、C：传统方法透明中籽粒形态；B、D：传统方法透明后籽粒形态；E：改进方法透明中籽粒形态；F：改进方法透明后籽粒形态。

对经过不同脱水时间处理的小麦籽粒均进行乙醇二甲苯逐级透明，当前期脱水不充分，在透明过程中籽粒多出现局部皱缩(图3A、C、E)，有些籽粒虽仍然饱满但颜色加深(图3 B、G、I)。当前期小麦籽粒脱水充分后，透明后籽粒均饱满且呈现淡黄色(图3D、F、H、J)，且70%乙醇脱水2 h以上结果差异不明显，故确定最佳70%脱水时间为2 h，最佳无水乙醇脱水时间为4 ℃10 h。确定最佳脱水方案为：30%乙醇、1 h→50%乙醇、1 h→70%乙醇、2 h→85%乙醇、1 h→90%乙醇、1 h→95%乙醇、1 h→无水乙醇、4 ℃10 h。

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J：不同脱水处理后使用改进方法透明的籽粒形态。

2.2.2 充分浸蜡可以保证切片时组织的完整性

小麦籽粒浸蜡是否充分与处理时间和温度都有关。结果(表2)显示，直接使用高温浸蜡(程序1)，籽粒明显皱缩，颜色加深呈深黄色或黄褐色(图4A、B)，切片时蜡带中间有明显孔洞，且有粉末掉落，不能够完整切片(图5A、C)。当使用逐级浸蜡程序2时，籽粒在浸蜡过程中仍然饱满，颜色呈淡黄色(图4C、D)，直至包埋后仍无明显改变，可以完整切片(图5B、D)。当缩短处理时间，使用程序3时，切片效果与程序2无差异，且节约了时间。故最佳浸蜡程序为逐级浸蜡，即二甲 苯∶石蜡=3∶1、37 ℃，直至溶解；二甲苯∶石 蜡=2∶1，42 ℃，直至溶解；二甲苯∶石蜡= 1∶1， 47 ℃，直至溶解；纯石蜡，60 ℃，18 h。

A、B：传统方法浸蜡后籽粒形态；C、D：改进方法浸蜡后籽粒形态。

A：传统浸蜡方法处理后包埋籽粒(横切面)；B：改进浸蜡方法处理后包埋籽粒(横切面)；C：传统浸蜡方法处理后切片蜡带(孔洞， 粉末)；D：改进浸蜡方法处理后切片蜡带(籽粒横切面)。

2.3 小麦籽粒显微结构观察

2.3.1 小麦籽粒横切面观察

应用改进的方法可以切出连续的蜡带，制作完整的籽粒横切片。由小麦籽粒横切面显微结构可见，授粉后第0～6天的籽粒，外围是厚厚的果皮，果皮厚度约占籽粒横径的一半，在籽粒腹部果皮的正中央有明显的凹陷(图6A、图7A、图8A、图9A)。随着灌浆物质的积累，小麦籽粒逐渐发育成熟，授粉后第8天的籽粒横切面显示，籽粒腹部的凹陷充实膨胀，胚乳细胞也明显充实，籽粒横切面由倒心形充实为接近圆形(图10A)。随着灌浆物质的继续积累，小麦籽粒逐渐发育成熟，授粉后第10～14天的籽粒横切面显示，籽粒果皮进一步退化，中央胚乳部分继续充实膨胀，与授粉后前6 d的籽粒相比，胚乳所占比例大大增加，外面仅有很薄的果皮包被，果皮厚度和细胞层数明显减小(图11A、图12A、图13A)。

A：籽粒(横切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍观)；C：中果皮(A中黑框C高倍观)；D：内果皮(A中黑框D高倍观)；Pe：果皮；CV：中央液泡；SG：淀粉粒；Nu：细胞核。

A：籽粒(横切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍观)；C：中果皮(A中黑框C高倍观)；D：内果皮(A中黑框D高倍观)；Pe：果皮；CV：中央液泡；SG：淀粉粒；Nu：细胞核。

A：籽粒(横切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍观)；C：中果皮(A中黑框C高倍观)；D：内果皮(A中黑框D高倍观)；E：外周胚乳(A中黑框E高倍观)；F：中央胚乳(A中黑框F高倍观)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：细胞核。

A：籽粒(横切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍观)；C：中果皮(A中黑框C高倍观)；D：内果皮(A中黑框D高倍观)；E：外周胚乳(A中黑框E高倍观)；F：中央胚乳(A中黑框F高倍观)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：细胞核。

A：籽粒(横切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍观)；C：中果皮(A中黑框C高倍观)；D：内果皮(A中黑框D高倍观)；E：外周近糊粉层胚乳(A中黑框E高倍观)；F：外周近中心胚乳(A中黑框F高倍观)；G：中央近腹部胚乳(A中黑框G高倍观)；H：中央近中心胚乳(A中黑框H高倍观)；I：中央近背部胚乳(A中黑框I高倍观)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：细胞核。

A：籽粒(横切面)；B：果皮(A中黑框B高倍观)；C：外周近糊粉层胚乳(A中黑框C高倍观)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍观)；E：中央胚乳腹部(A中黑框E高倍观)；F：中央胚乳背部(A中黑框F高倍观)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：细胞核。

A：籽粒(横切面)；B：果皮(A中黑框B高倍观)；C：外周近糊粉层胚乳(A中黑框C高倍观)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍观)；E：中央近腹部胚乳(A中黑框E高倍观)；F：中央近背部胚乳(A中黑框F高倍观)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：细胞核。

A：籽粒(横切面)；B：果皮(A中黑框B高倍观)；C：外周近糊粉层胚乳(A中黑框C高倍观)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍观)；E：中央近腹部胚乳(A中黑框E高倍观)；F：中央近背部胚乳(A中黑框F高倍观)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒。

2.3.2 果皮显微结构观察

小麦果皮由子房壁发育而来，外果皮细胞1～2层，呈方形或长方形；中果皮细胞数量较多，呈多边形；内果皮靠近胚乳，由靠外侧体积较大的横细胞和1层排列规则的管细胞组成。授粉当天，果皮三层结构完整，开始出现较少量淀粉粒，中果皮中淀粉粒积累相对较多较少(图6B～D)。授粉后第2天，果皮中淀粉粒呈圆形，体积较小，在果皮三层结构中没有明显差异(图7B～D)。授粉后第4 8天，可以清楚看到中果皮薄壁细胞内积蓄的淀粉粒数量明显增多，体积明显变大，内果皮中次之，外果皮中淀粉粒最少(图8B D、图9B D、图10B D)。授粉后第10～14天，小麦籽粒横切面果皮显著变薄，最薄处仅由4～5层细胞构成，而且果皮中积蓄的淀粉粒数量逐渐减少，体积也变小(图11B、图12B、图13B)。

2.3.3 胚乳显微结构观察

小麦授粉后第0～2天的籽粒中央为一个大液泡，胚乳处于游离核阶段，无淀粉粒积蓄。授粉后第4天，胚乳细胞开始形成细胞壁，细胞网状轮廓清晰可见，尚未积蓄淀粉粒(图8E、F)。授粉后第6天，胚乳继续进行细胞分化，开始积蓄少量淀粉粒(图9E、F)。随着时间的推移，授粉后第8天，胚乳细胞层数增加并趋向充满胚囊，腹部胚乳细胞、背部中心和糊粉传递细胞中已有淀粉粒累积，此时淀粉粒呈圆球形，体积仍较小，而背部近糊粉层胚乳细胞仍具有较多胚乳核，未出现淀粉粒(图10E～I)。授粉后第10～12天，小麦籽粒腹部胚乳细胞逐渐被淀粉粒充满，淀粉粒体积逐渐增大，数量逐渐增多，背部胚乳继续向无核化发展(图11C～F、图12C～F)。授粉后第14天，胚乳细胞中几乎完全充满淀粉粒，淀粉粒体积明显增大，多为椭圆形和球形(图13C～F)。

3 讨 论

3.1 糯小麦果皮和胚乳淀粉积累特征

随着小麦籽粒发育成熟，果皮发育与胚乳发育相协调。Xiong等研究认为，授粉后第3天果皮中开始积累淀粉体，授粉后第7～9天果皮内淀粉体增至最多，随后开始消失。Zheng等发现，小麦颖果授粉后第3天果皮厚，授粉后第6天果皮薄壁细胞明显退化。刘大同等观察发现，授粉后第5天果皮中淀粉粒较丰富，授粉后第10天果皮中淀粉粒数量增多、体积增大，随后逐渐解体。本试验也有类似结果，紫糯小麦授粉当天到第14天，果皮具有明显的生长和消亡过程，果皮内淀粉粒也随之累积和降解。授粉当天到第4天的小麦籽粒，主要是果皮中逐渐积蓄淀粉粒，这可能与籽粒发育初期营养供给有关。授粉后第6～8天，小麦籽粒果皮中淀粉粒蓄积最多，且淀粉粒在内、中、外三层果皮中体积和数量分布呈现明显差异，该阶段果皮中淀粉粒增至最多，与胚乳细胞开始发生增殖和分化的时期基本一致，这可能与胚乳发育初期营养物质提供相关。授粉后第10天开始淀粉粒逐渐降解，被分解为营养物质，以供胚乳细胞充分吸收和利用。

小麦籽粒的生长发育伴随着胚乳发育和淀粉积累。研究表明，在授粉后第5～6天时，小麦籽粒胚乳淀粉体首先在靠近细胞核的区域出现，授粉后第8～24天逐渐发育和富集。Jing等发现，普通小麦授粉后第4天开始出现少量淀粉粒，胚乳细胞化过程在授粉后第3天、4天开始，且由外向内进行，直至完全充满。余徐润等研究发现，小麦近糊粉层胚乳细胞比中央胚乳细胞内的淀粉粒体积小且数量少。本试验中，小麦籽粒发育早期胚乳细胞的分化与淀粉粒的积蓄也遵循同样的规律，授粉后第6天，胚乳细胞开始分化，出现极少量淀粉粒。授粉后第8～12天，胚乳继续向无核化发展，淀粉粒积累在胚乳横切面上呈现明显差异，相对于近糊粉层细胞，中心细胞积累较快，淀粉粒充实度更好；腹部胚乳细胞较背部细胞积累多，背部糊粉传递细胞比近糊粉层细胞积蓄更快。授粉后第14天，淀粉粒积蓄已接近饱和，说明授粉后第8～14天淀粉粒积累迅速，是胚乳发育和淀粉粒形成的重要时期。Xiong等观察发现，授粉后第15天小麦胚乳淀粉体数量分布呈显著差异，腹部近糊粉层胚乳细胞比中心细胞内淀粉体数量多，背部中心胚乳细胞中淀粉体数量多于糊粉传递细胞。与之不同，本试验发现，授粉后第8～14天小麦背部糊粉传递细胞内淀粉粒积累比近糊粉层胚乳细胞更多、更快，这可能与小麦胚乳淀粉积累时序存在品种差异 有关。

3.2 石蜡切片技术的优化

材料脱水、透明和浸蜡环节是影响切片质量的重要因素。康海岐等研究发现，质量分数为70%、83%、95%浓度梯度材料容易脱水且不易收缩。于晓刚等发现，将脱水步骤改为70%过夜、85%、95%、100%(每次2 h)及100%(1.5 h)乙醇溶液，组织材料不易变形且有利于脱水。张润琪等采用酒精氯仿逐级混合透明，透明总用时达81 h；逐渐升温浸蜡，但是前21 d的小麦籽粒浸蜡总时间长达84 h，切片厚度为10～25 μm。本试验初期在常规石蜡切片技术基础上，借鉴前述方法，制作了小麦籽粒石蜡切片，发现制作的授粉后第4天、第6天、第8天小麦籽粒的切片效果相对较好，但是授粉当天和授粉后第2天的小麦籽粒有皱缩现象，授粉后第10天后的小麦籽粒后续环节中颜色加深，无法制出10 μm的切片。后期试验进行了改进，乙醇梯度脱水从30%浓度开始，70%乙醇脱水时间为2 h，100%乙醇步骤为 4 ℃脱水10 h，这样降低了高浓度脱水对材料的影响，也增强了脱水效果。结果表明，授粉后第14天之前的小麦籽粒均可充分脱水，且不变形。透明环节改为乙醇和二甲苯逐级透明(无水乙醇 二甲苯=3∶1→无水乙醇∶二甲苯=2∶1→无水乙醇∶二甲苯=1∶1→纯二甲苯，各1 h)，籽粒明显不皱缩不变颜色。浸蜡方法改为从37 ℃开始逐级浸蜡，先是在纯二甲苯中加入少量碎蜡粒，然后逐渐增加石蜡，同时逐渐升高温度，效果改善明显。该优化技术在其它小麦品种石蜡切片中也进行了应用，表现出明显的改良效果(数据未显示)，表明改进的石蜡切片制作方法适合于早期小麦籽粒的结构研究。