ω-黑麦碱基因表达缺失的1BL/1RS易位系种质创新

张士昌，李亚青，张 楠，彭义峰，李孟军

(石家庄市农林科学研究院/河北省小麦工程技术研究中心，河北石家庄 050041)

栽培黑麦(L.)是改善小麦重要性状和丰富其遗传多样性的优良基因供体。黑麦1R染色体短臂(1RS)取代普通小麦1B染色体短臂(1BS)形成的1BL/1RS易位系具有黑麦1RS携带的抗叶锈、秆锈、条锈和白粉病等抗性基因，同时具有良好的丰产性和适应性。1980-2002年，中国小麦育成品种中，1BL/1RS易位系品种在全国主要麦区平均占比38%，其中北方冬麦区和黄淮冬麦区分布频率分别为59%和42%，但因1BL/1RS易位系对加工品质具有负向效应，在优质强筋小麦品种中，1BL/1RS易位系比较罕见，只有郑麦7698、烟农21等少数优质强筋小麦品种为1BL/1RS易位系。一般认为，1BL/1RS易位系加工品质低劣的主要原因有：(1)1BS上编码低分子量麦谷蛋白亚基的位点和编码γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的位点的丧失；(2)1RS上编码40 K γ-黑麦碱和ω-黑麦碱的位点的导入。因此，改良1BL/1RS易位系加工品质的主要途径包括：(1)在1RS末端导入和位点；(2)降低或沉默ω-黑麦碱基因位点的表达；(3)导入优质高分子量麦谷蛋白亚基。

1RS上位点编码40K γ-黑麦碱和ω-黑麦碱，其中，ω-黑麦碱富含谷氨酰胺，几乎不含有半胱氨酸，分子间和分子内无二硫键，可使面团吸水性增大，持水性、稳定性和延伸性降低，导致1BL/1RS易位系的烘烤和蒸煮品质下降。降低或沉默ω-黑麦碱基因表达的主要途径包括：(1)利用部分同源染色体配对交换，通过易位使位点缺失；(2)采用反义RNA或RNA干扰技术降低甚至沉默ω-黑麦碱基因的表达；(3)利用辐射诱变技术使位点缺失，如利用快中子辐射创制的衡观35的突变体。

冬小麦品种石麦15是石家庄市农林科学研究院小麦研究所选育的节水高产抗逆品种，但其加工品质表现不佳。为了发掘其在育种和生产中的利用价值，本研究利用N离子束诱变技术，采用醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺电泳方法(A-PAGE)验证筛选ω-黑麦碱表达突变株系，创制了一系列ω-黑麦碱基因表达缺失且农艺性状无显著改变的新型1BL/1RS易位系，并对这些新种质的农艺性状和品质性状进行分析，以期为培育优质抗逆1BL/1RS易位系提供新的种质和思路。

1 材料与方法

1.1 供试材料

冬小麦品种石麦15 由石家庄市农林科学研究院小麦研究所提供。精选石麦15小麦种子以胚向上的方式摆放在靶盘中，靶盘放置在离子注入机(UIL.0.512，TNV，俄罗斯强电研究所)的真空靶室中(真空度3×10Pa)进行N束(荷能30 keV)注入，注入剂量分别为4×10N·cm和6×10N·cm。每个剂量重复3次，一次重复使用500粒种子。辐照后的小麦种子(M)点播种植，株距10 cm，行距30 cm，单株收获后获得M代。将M代种子按单株分行种植，株距10 cm，行距30 cm，每个株行随机收获10个单穗，单穗脱粒后获得M代。M～M代种植方法与M代一样，单株收获。M代获得ω-黑麦碱表达缺失突变稳定株系。将M代获得的1BL/1RS易位系种子进行微区种植，全部收获，用于农艺性状观察和品质分析。

1.2 方 法

1.2.1 ω-黑麦碱基因表达缺失突变体的筛选

ω-黑麦碱基因表达缺失突变体筛选采用A-PAGE技术，略有改动。每个M单穗随机选取3粒种子，切取远胚端约1/2粒，砸碎，加入100 μL提取液(50% 2-氯乙醇，0.05%甲基绿，20%甘油)，4 ℃提取过夜；12 000 rpm离心5 min，上清液即为醇溶蛋白电泳样品。聚丙烯酰胺胶浓度为12%，交联度为2.5%；恒压300 V，电泳时间2 h。染色过夜，拍照记录。

1.2.2 1RS染色体臂的分子标记检测

采用植物基因组提取试剂盒(天根，北京)提取叶片DNA。引物AF1/AF4、O11B3/O11B5、Bmac0213、IAG95-1、SCSS30.2、IB-267的合成及PCR扩增程序参照文献。PCR反应体系：2×Taq PCR StarMix(Genstar)10 μL，引物(10 μmol·L)各1 μL，模板DNA 50～100 ng，ddHO补充至20 μL。所有引物均由Invitrogen公司合成。引物O11B3/O11B5是1BS特异引物；引物AF1/AF4 、Bmac0213、 IAG95-1、SCSS30.2和IB-267是1RS特异引物。引物AF1/AF4在1RS上有多个结合位点；引物IAG95-1、SCSS30.2、IB-267结合位点在位点靠近1RS末端一侧，为1RS末端抗病基因标记，可标示1RS末端的存在与否。引物Bmac0213结合位点在位点靠近着丝粒一侧。这些引物可反映1RS的有无和缺失区段。

1.2.3 ω-黑麦碱基因表达缺失突变体的农艺性状分析

ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系采用随机区组设计进行小区产量比较试验。每个小区8行，行长10 m，行距0.15 m，3 次重复，基本苗300万株·hm，其他管理同一般大田。产量及其构成因素按李雁鸣的方法进行。收获前定点调查各小区穗数；连续取20穗，计算穗粒数；成熟期各小区全部收获，晒干后称重，计算千粒重和产量。数据分析采用DPS v3.0分析软件进行。

1.2.4 ω-黑麦碱基因表达缺失突变体的品质性状分析

ω-黑麦碱基因表达缺失突变体的品质性状分析在石家庄市农林科学研究院品质分析实验室进行。根据NY/T 1094-2006标准，采用MLU 202实验磨制粉；根据GB/T 24899-2010标准，采用Perten 7200近红外谷物品质分析仪测定蛋白质含量；根据GB/T 5506.2-2008标准，采用Perton 2200型面筋指数仪测定面粉湿面筋含量；根据GB/T14614-2006标准，采用Brabender 810110型粉质仪测定粉质参数。采用DPS v3.0分析软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 ω-黑麦碱基因表达缺失突变体的鉴定

A-PAGE电泳图谱(图1)显示，1BL/1RS易位系石麦15 ω-醇溶蛋白具有1RS特征条带，而9个突变株系无此特征条带。这表明，获得的突变株系为ω-黑麦碱基因表达缺失突变体(图1A)。引物AF1/AF4和引物O11B3/O11B5 扩增结果表明，9个突变株系仅含有1RS(图1B,C)。引物Bmac0213引物扩增结果表明，9个突变株系在标记Bmac0213位点附近缺失片段大小不同(图1D)。引物IAG95-1、IB-267、SCSS30.2扩增结果显示，9个突变株系1RS末端存在差异(图1E,F,G)。

A：ω-醇溶蛋白A-PAGE电泳图谱；B：引物AF1/AF4 PCR扩增结果；C：引物O11B3/O11B5扩增结果；D：引物Bmac0213 PCR扩增结果；E：引物IAG95-1 PCR扩增结果；F：引物IB-267 PCR扩增结果；G：引物SCSS30.2 PCR扩增结果；M：DNA Marker DL 2000 plus；1：石麦15；2～10：ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系，分别为A05、A12、A19、A22、A45、A62、A77、A89和A95；11：师栾02-1；12：ddH2O。

2.2 ω-黑麦碱基因表达缺失突变体的农艺表现

从表1可以看出，9个ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系的株高、穗数、穗粒数、千粒重和产量5个农艺性状与石麦15均无显著差异，这表明，ω-黑麦碱基因表达缺失对突变株系的农艺性状没有造成显著影响。ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系之间在株高上无显著差异，但在穗数、穗粒数、千粒重和产量指标上，部分突变株系表现出显著 差异。

表1 ω-黑麦碱表达缺失突变株系的农艺性状Table 1 Agronomic traits of 1BL/1RS translocation lines with ω-secalin absence

2.3 ω-黑麦碱基因表达缺失突变体的加工品质

从表2可知，大部分ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系的籽粒蛋白质含量、吸水率、湿面筋含量和面团稳定时间与石麦15均存在显著差异，这表明，ω-黑麦碱基因表达缺失对突变株系的加工品质有显著影响。面团稳定时间反映面团的耐揉性，是评价面粉品质优劣的重要指标。ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系面团稳定时间为2.6～3.8 min，是石麦15的1.6～2.4倍，说明ω-黑麦碱基因表达缺失显著改善了石麦15的面粉品质。

表2 ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系的加工品质Table 2 Grain processing quality of 1BL/1RS translocation lines with ω-secalin gene absence

3 讨 论

1BL/1RS易位系作为育种亲本，在我国育成了一批具有影响力的小麦品种，如石4185、邯6172、矮抗58、郑麦7698等，对于提高我国小麦抗病性、丰产性和稳产性发挥了重要作用。近年来，随着人们生活水平的提高，对小麦产品的品质提出了更高的要求，而1BL/1RS易位系因其对小麦品质具有负向效应，导致其在小麦育种中的应用减少。为了既充分利用1BL/1RS易位系的丰产抗逆特性，同时又避免其加工品质缺陷，一些研究者利用突变体诱导部分同源重组、基因工程技术、辐射诱变、导入优质高分子量麦谷蛋白亚基等方法，对1BL/1RS易位系进行了改良，期望获得丰产抗逆优质1BL/1RS易位系。

Martin等认为，1BL/1RS易位系面包品质不佳的主要原因在于1RS上位点编码的黑麦碱，而不在于1BS编码的低分子量麦谷蛋白和醇溶蛋白。因此，降低或沉默1RS上位点的表达是利用1BL/1RS易位系培育高产抗病优质小麦新品种的关键措施。Lukaszewski利用缺失突变体，通过诱导 1RS和 1BS 的部分同源重组的方法，已成功创制位点缺失的1BL/1RS易位系。晏本菊等利用不同的黑麦亲本资源，获得ω-黑麦碱基因缺失的1BL/1RS易位系。柴建芳等利用RNA干涉技术沉默了ω-黑麦碱基因的表达。以上这些途径虽然都可以创制ω-黑麦碱基因表达缺失突变体，但这些方法在对1BL/1RS易位系小麦品种进行改良时，均存在着很大的局限性。

ω-黑麦碱由位点上ω-黑麦碱基因家族编码，应用辐射诱变技术可以获得ω-黑麦碱基因表达缺失突变体，如王道文课题组利用快中子辐射创制了衡观35的突变体。1BL/1RS易位系石麦15是一个节水高产品种，但其加工品质不佳，对其推广应用造成不利影响。本课题组利用N离子束诱变技术创制了石麦15突变体群体，经过连续田间和A-PAGE选择获得了ω-黑麦碱基因表达缺失的1BL/1RS易位系稳定株系。N离子束诱变对小麦农艺性状具有不利影响，但经过田间对ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系的农艺性状进行多代选择，克服了辐射诱变对农艺性状的负向效应。虽然ω-黑麦碱基因表达缺失突变株系1RS上缺失片段大小不同以及部分突变株系1RS末端缺失，但其加工品质均得到了改良。目前，我们正在开展以下工作：(1)利用缺失突变体在1RS末端导入/位点；(2)利用分子标记技术，通过常规杂交导入优质高分子量麦谷蛋白亚基。我们期待通过以上工作进一步提高1BL/1RS易位系加工品质，创制出丰产抗逆优质1BL/1RS易位系。