液体活检在转移性乳腺癌诊疗中的应用进展

朱凌霄， 肖 春， 张建华

在全世界范围内，乳腺癌作为女性肿瘤中发病人数以及恶性程度较高的疾病之一，其近年来的死亡率逐步下降，但转移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)仍是一种无法治愈的疾病。根据2021年的最新数据统计，全球范围内的女性恶性肿瘤中乳腺癌发病率高居首位，很大程度上影响女性的身心健康及生命安全[1]。随着医疗的发展进步以及社会层面对于乳腺相关疾病的宣教科普，人们对于乳腺癌的认识逐渐深入，早期诊断乳腺癌的患者比例逐年增加，但是仍有相当一部分患者确诊时已经出现局部转移甚至远处转移。有数据显示，MBC患者的5年生存率只有38%[2]。液体活检技术有别于传统的穿刺活检技术，具有创伤小、操作性强以及灵敏度高等优点，且可重复操作，在乳腺癌诊疗的整个过程中都可发挥指导作用。本文就液体活检技术在MBC诊疗中的应用进展进行综述。

1 液体活检技术概论

液体活检技术是一种侵入性较小的、针对恶性肿瘤的无创诊断检查技术，因为其可以减轻患者在手术或者穿刺活检等侵入性检查中的痛苦而受到了广泛关注[3]。液体活检主要是通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、高通量测序、酶联免疫吸附检测以及生物传感器等技术，对于原发性肿瘤在发生发展过程中分泌到人体外周体液中的各种组分进行测定和分析，从而完成对于恶性肿瘤的早期筛查、用药指导、病情进展评估和治疗效果观察等，可贯穿应用于疾病的诊疗全程[4]。液体活检大致可分为两大类：血液来源的生物标志物和其他来源的有临床诊断价值的生物标志物(例如：唾液、脑脊液、尿液、胸腹腔引流液等)。血液来源的标志物主要是游离DNA(circulating free DNA,cfDNA)，其中包括循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、微小RNA(microRNA,miRNA)、外泌体、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)以及肿瘤诱导血小板(tumor-educated platelets,TEPs)等。液体活检具有动态实时监测微小残留病灶，对肿瘤进行基因分型以指导靶向治疗，以及跟踪肿瘤演变的潜力[5]。此外，与单次组织活检相比，液体活检可以通过检测原发性和继发性肿瘤释放的肿瘤细胞或物质来反映病灶间和病灶内的异质性，并提供更全面的癌症分子谱。

2 液体活检主要标志物研究进展

2.1CTCs 外周血CTCs于1869年首先由T.R.Ashworth观察到并正式提出[6]，但它们的重要性在近20年才逐渐被理解并进行应用。CTCs从原发性肿瘤中分离，进入人体的循环系统，最后渗入淋巴结或远处器官。Mohme等[7]研究证实，CTCs在形成转移性病灶之前首先进入循环系统，可能比临床影像学表现及临床体征更敏感，更有助于临床尽早采取干预措施。在脱离原发灶之前，CTCs改变了自身形态及表面蛋白，具有不同寻常的特性，主要是指经历上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)后获得间充质样表型，失去细胞间相互作用和细胞极性后分泌多种酶以消化细胞外基质并获得迁移能力[8]。这些迁移的CTCs渗透至全身并最终定植到合适的位置后进行间充质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition，MET)，重新获得上皮特性并完成远处转移[9]。但是，由于外周血中CTCs的含量很少，所以如何针对其进行筛选、富集成为当前技术的核心问题。关于CTCs的分离、筛选以及富集方法目前依据三个方面，其一是根据CTCs区别于正常细胞的一些物理学特性，如大小、表面电荷、密度以及抗压能力等进行筛选，包括ISET系统、Screen Cell系统、Oncoquick系统、双向电泳系统以及流体辅助分离技术等；其二是基于CTCs的表面免疫相关的生物标志物来进行筛选，如Cellsearch系统[首个且唯一经过美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准进入市场的技术]、Adnatest系统以及MACS系统等；其三是联合前两者的新型微流控芯片技术，能够特异性筛选并捕获CTCs后完成高效有序的富集过程[10]。虽然目前检测方法越来越多，但是能够大范围应用于市场的主流技术仍较少。

2.2ctDNA和cfDNA 除了CTCs外，ctDNA本身亦携带与恶性肿瘤有关的基因信息，近年来在临床上应用越来越广泛。既往研究显示，cfDNA在恶性肿瘤的临床诊治中发挥了重要作用，ctDNA只是cfDNA中的一小部分，二者的比例称为循环肿瘤分数(circulating tumor fraction,cTF)。cTF在肿瘤体积较小且局限时通常很低，但随着肿瘤生长和转移而增高[11]。不同癌症患者之间的ctDNA水平可能有很大差异。这种差异是由于肿瘤类型的差异造成的，有一些癌症(如结直肠癌)与高水平的ctDNA相关，也有一些癌症(如神经胶质瘤)与较低水平的ctDNA相关[12]。尽管如此，即使在癌症类型相同的患者中，ctDNA水平也可能有很大差异。在个体患者中，随着时间的推移，ctDNA水平与总体肿瘤负荷的波动仍密切相关。考虑到循环中cfDNA的半衰期很短(大约1 h)，ctDNA已被提议作为整体肿瘤负荷的潜在替代物，可用于通过连续抽血监测治疗期间的反应[13]。一般来说，使用ctDNA监测治疗反应和肿瘤负荷变化的最敏感和最有效的方法是识别特定个体肿瘤的基因组改变，并在患者的血液中进行追踪。ctDNA在外周血中浓度极低，且半衰期很短，因此检测难度较大。目前主要的检测手段包括数字化PCR(如微滴式数字PCR、BEAMing技术等)以及二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)，旨在评估单个DNA分子，可以检测cfDNA中突变频率为0.01%甚至更低的等位基因。值得一提的是，为了避免NGS反应中聚合酶发生错误，目前已经开发了“分子条形码”技术，即每个原始模板中的DNA分子都带有个性化的条形码，以帮助区分原始模板分子中存在的真正突变和聚合酶过程中引入的错误反应[14]。使用这种方法，再加上深度测序覆盖和错误抑制算法，可以进一步优化检测和分析ctDNA的方法，并有助于扩大潜在的临床应用。

2.3外泌体 外泌体是源自细胞的纳米级膜包裹囊泡，通过质膜的连续内陷最终形成多囊泡体，并在各种机制的协同作用下与细胞质膜融合，最终被分泌出去[15]。由于多囊泡体可以与其他细胞内囊泡和细胞器相互作用，导致外泌体成分的多样性，它们性质非常稳定并能穿梭于体液中[16]。外泌体中转运的成分包括蛋白质、各种类型的RNA(miRNA、lncRNA、mRNA)和各种DNA。这些生物标志物通过递送信息至受体细胞来影响基质修饰和血管生成的进程[17]。此外，外泌体通过改变免疫细胞的表型来重新激活机体抑制肿瘤细胞的活性，从而促进肿瘤微环境中的免疫抑制[18]。与前文所述的CTCs、ctDNA不同的是，外泌体还具有自我调节功能，可以通过自分泌或旁分泌机制调节邻近细胞和远处靶细胞，介导机体的生理和病理活动。总而言之，外泌体参与肿瘤发生发展过程中的血管生成、EMT、侵袭转移、免疫逃逸、耐药等方面，具有良好的临床应用前景[19]。外泌体的分离方法主要取决于其组成成分以及物理性质[20]。目前用于外泌体分离的常用技术包括超速离心、过滤、聚合物共沉淀、尺寸排除色谱法、磁性相关细胞无接触分选以及微流体过滤等。其中超速离心法广泛用于外泌体的分离，但由于纯度低，难以在临床上应用[21]。虽然循环外泌体的分析很方便，但外泌体的最终临床应用仍处于初步阶段，需要更多研究来验证。

3 液体活检在MBC诊疗中的临床应用及研究进展

3.1CTCs在MBC诊疗中的应用及研究进展 在早期乳腺癌中，CTCs可以在大部分患者中被检测到，并且被认为是微小残留癌灶的标志物以及远期MBC的潜在发生前兆[22]。近几十年来，基于CTCs能够实时反映肿瘤负荷和转移部位的特性，CTCs已被确定为MBC的一个强有力的预后因素，多项研究表明其具有指导治疗决策的潜力[23]。除了基于肿瘤细胞的分析之外，还可以在外周血中常规检测循环核酸，例如DNA和RNA片段[24]。基于CTCs诊断的主要优势之一是能够以非侵入性方式进行连续测量，提供对疾病生物学的实时观察，并可能因此改变治疗方案。由于预测标志物[例如激素和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)]状态以及新的治疗相关靶点可能会在疾病过程中发生变化，因此液体活检有可能成为乳腺癌转移情况下侵入性组织检查的替代方法[25]。在Cellsearch系统中，每7.5 ml血液中检测出5个CTCs作为临界水平以区分MBC预后良好和不良的患者，CTCs>5个的患者临床无进展生存期(progression-free survival,PFS)以及总生存期(overall survival,OS)均显著降低，而且通过进一步治疗后复查CTCs数值仍较高者的生存期更短，说明液体活检在某种程度上灵敏度是高于常规影像学检查的，而且可以更连续地对疾病的发展及预后进行评估[26]。最近发表了2项关于CTCs在MBC中预后价值的大型分析。一项是Cristofanilli等[27]进行的汇总分析，对来自18个中心的近2 500例MBC患者的血液样本进行了评估，其中533例女性患有新发转移性癌症，Cellsearch系统用于CTCs检测结果显示，CTCs升高的患者往往显示更差的预后(OS：CTChighvs CTClow为16个月 vs 36.3个月)，而且转移部位与乳腺癌分型无明显关联。在患有新发转移性疾病的MBC患者中，升高的CTCs计数也与较短的OS相关(18.7个月 vs 41.4个月)。而且CTCs是MBC多变量分析中最强的OS预测因子(HR=2.71，95%CI：2.35～3.12)。另一项是由Müller等[28]建立的DETECT研究小组对1 933例MBC患者的血液样本进行了分析，这项试验是全球最大的基于CTCs的治疗干预的研究项目，旨在指导CTCs在MBC靶向治疗中的临床应用。在DETECT Ⅲ期试验中，HER2阴性和HER2阳性的患者被随机分配接受标准治疗加用或不加用拉帕替尼抗HER2治疗；HER2阴性患者参加DETECT Ⅳa期和Ⅳb期研究，证实了CTCs计数在MBC中的高度预后相关性。结果显示1个CTC和5个CTCs作为临界值时均与患者中位OS显著相关(≥1个CTCs患者的中位OS 15.5个月 vs CTCs阴性患者的中位OS 37.2个月；≥5个CTCs患者的中位OS 12.0个月 vs <5个CTCs患者的中位OS 28.6个月)。还有试验表明CTCs可以作为指导雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性乳腺癌患者一线治疗的生物标志物[29]。在激素受体阳性MBC患者中也观察到不同的临床症状，这取决于存在的CTCs数量[30]。此外，即使在乳房手术后5年内，在没有活动性疾病证据的患者中CTCs水平较高者5年内复发及转移风险也较高[31]。由于大多数患者在全身治疗期间CTCs计数均减少，因此对CTCs计数水平进行持续性检测有助于识别并筛选出对于当前治疗反应不佳的患者，可以帮助患者规避低效且有副作用可能较大的药物，或者改用其他有效的治疗方案。SWOG S0500试验[32]对此进行了论证。在这项研究中，在开始一线化疗治疗之前，取595例MBC患者的血样测量了CTCs指标并记录，在进行了第1个周期治疗后取得了第2份血样。持续高CTCs计数的患者被随机分配至继续治疗，直至临床进展期(标准组)或切换到另一种化疗方案(对照组)。结果显示CTCs数量较低的患者具有更好的临床结果(中位OS为35个月)，但两组CTCs数量持续较高的患者的预后相似。因此，一线化疗1个周期后CTCs未减少的MBC患者改用替代化疗方案既没有改善OS，也没有改善PFS。但是值得注意的是，在此研究中CTCs数量较低的患者预后良好，激素受体阳性和HER2阳性患者的中位OS超过3年。即使是三阴性乳腺癌患者，其中位生存期也接近2年[33]。考虑到患者更有可能从免疫、靶向或试验性治疗中受益，笔者建议在1个化疗周期后发现CTCs增加的患者，应在疾病进展期间积极考虑参加新型治疗药物的试验，而不是继续进行第2周期或者替代的化疗。近期亦有一项研究(CirCe01试验)旨在评估基于CTCs的监测在MBC中的临床效用[34]，虽然此研究规避了SWOG S0500试验的不足以及局限性，并在这项随机Ⅲ期研究中探索了三线方案，以避免重新选择化疗方案。但是该研究最终亦未能得到理想的结果，可能是因为基于CTCs的监测组中的患者没有获得更长的OS，还有患者对于基于CTCs的治疗转换方案的接受度较低以及招募人数不足等。最近的一项研究证明了CTCs数据在临床决策中的效用，不仅考虑了CTCs的数量，而且还考虑了CTCs的表型[9]。但是关于临床上MBC患者如何从CTCs监测中获益，仍然需要进一步的研究证实。

3.2ctDNA在MBC诊疗中的应用及研究进展

2019年，在中国临床肿瘤学会《乳腺癌诊疗指南》中首次指出CTCs和ctDNA可以作为循环肿瘤标志物预测早期和晚期乳腺癌预后的价值[35]。正如前文所述，多项大型研究及后期的荟萃分析均证实了CTCs在MBC中的预后意义，但是涉及到ctDNA在MBC中的诊疗价值尚需大量临床数据支持。迄今为止，只有少数研究评估了ctDNA在MBC中的预后意义。Shaw等[36]比较了112例MBC患者的CTCs和ctDNA的突变谱，通过检测磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinasecatalytic subunit alpha,PIK3CA)、鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、肿瘤蛋白53(tumor protein 53,TP53)和雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)基因的突变与升高的ctDNA水平，发现二者均与MBC明显缩短的OS相关，并且ctDNA和CTCs中的突变谱是一致的。Tan等[37]对10项试验的荟萃分析仅包括1 127例患者，高水平的cfDNA和外周血中存在ctDNA与乳腺癌患者的不良预后显著相关。而且与高水平的cfDNA相比，ctDNA的检测可以更有效地预测生存结果。按样本来源分类的进一步亚组分析表明，cfDNA可以作为乳腺癌患者的预测和预后标志物。按肿瘤分期分类的亚组分析表明，cfDNA适用于乳腺癌患者的早期和转移期。在Fernandez-Garcia等[38]的研究中，对来自194例MBC患者的血液样本进行了CTCs计数、cfDNA水平和肿瘤标志物癌胚抗原153(carcino-embryonic antigen 153,CA153)的分析。结果显示高水平的cfDNA与较短的OS显著相关，总体cfDNA水平与CTCs计数相关。有研究表明ctDNA水平实际上可能在治疗开始后的最初几天短暂增加，这可能是由于肿瘤细胞死亡增加导致ctDNA脱落增加。然而，在对治疗有反应的患者中，ctDNA水平通常在1～2周后急剧下降[39]。还有研究证实，ctDNA水平的最终上升可能出现在影像学进展之前数周至数月，这表明ctDNA跟踪可以作为一种潜在的临床工具，用于评估患者发生耐药的可能性，并且可以结合当前临床监测方法，为后续治疗赢取更多的准备时间。2020年Pierga等[40]报道了前瞻性UCBG COMET试验的结果，对196例HER2阴性MBC患者在化疗前和第1周期结束后的ctDNA水平进行分析，并通过靶向重测序检测了几种体细胞突变，即TP53、PIK3CA、ESR1和HER2。结果显示，血浆中的TP53突变会影响MBC患者的PFS和OS，而PIK3CA和ESR1突变对患者的生存预后没有影响。此外，在第2周期化疗前可检测到ctDNA的患者OS显著缩短。总之，越来越多的证据表明ctDNA在MBC中具有预后影响。然而，由于各试验的设计思路以及验证方法不同，所以目前直接进行各试验之间的比较和汇总还是有一定难度的。

4 小结及展望

近年来，液体活检作为精准医疗的一种新方法，重视基于个人基因组、环境和生活习惯的个体化治疗，尤其是当实体组织活检不足或无法获得时，液体活检可以为恶性肿瘤的诊疗提供强有力的辅助。除了预测作用之外，液体活检可能是全面的肿瘤基因分型、识别紧急耐药机制、监测微小残留病灶、早期检测和癌症拦截的有用工具。随着临床上精准治疗理念的深入，乳腺癌的治疗方案亦逐年优化。对于外科医师来说，围手术期循环肿瘤标志物的变动分析可以早于常规影像学诊断去指导临床更快速地完善现行的乳腺癌治疗方案，最终帮助患者得到更好的治疗结果[41]。目前新循环生物标志物的发现和验证仍处于起步阶段，虽然多种生物标志物整合分析可以为临床医师提供更全面的诊疗思路，但是仍需要大量的循证医学研究证据来支持。相信在不久的将来，随着越来越多的相关研究结果的公开，液体活检技术在MBC以及其他恶性肿瘤的诊治中定能发挥出更大的作用。