牡丹远缘杂交障碍克服措施探析

2022-02-28王二强王晓晖冀含乐韩鲲卢林王占营

特产研究 2022年5期

王二强，王晓晖，冀含乐，韩鲲，卢林，王占营

（洛阳农林科学院，河南洛阳 471023）

牡丹为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）植物，在我国栽培历史悠久，分布广泛，深受我国各族及世界人民的喜爱，自古被尊为“花中之王”[1]。牡丹所有野生原始种均分布于我国，由革质花盘亚组（Subsection Vaginatae）和肉质花盘亚组（Subsection Delavayanae）两种类型9 个种构成，即卵叶牡丹、矮牡丹、杨山牡丹、紫斑牡丹、四川牡丹、大花黄牡丹、黄牡丹、紫牡丹和狭叶牡丹[2]。近年来，随着牡丹科研及应用领域的进一步推进，牡丹栽培用途已经由传统的药用、观赏发展到综合利用开发阶段。新、奇、特及专用型品种的培育一直是牡丹科研和生产的主要内容，目前国内栽培品种多是在品种群内或品种群间近缘杂交选育的结果，新品种培育在亚组内杂交已经难以有所突破，加大牡丹亚组间以及牡丹与芍药组间的种质基因交流培育远缘杂交品种将成为实现中国牡丹新品种重大突破的首要途径。相反国外培育的牡丹品种多通过亚组间和组间杂交而来，目前亚组间品种已超过1 000 个，主要分布于美国、欧洲和澳大利亚；组间杂种注册量已超150 个品种[3]。中国在牡丹远缘杂交育种方面虽有一定成效，但与欧美一些国家相比杂交工作的开展明显滞后，进展缓慢，牡丹远缘杂交品种在世界范围内的接受、推广程度差距甚远，富含优良性状的珍稀牡丹资源的挖掘、保护、研究和利用程度有限，尤其远缘杂交过程中出现的杂交不亲和及胚败育现象无法得到有效克服，导致牡丹远缘杂交新品种培育效率低下、突破有限。本文总结了近些年来牡丹组间及亚组间远缘杂交的一些经验，并分析了远缘杂交过程中花粉受精前后障碍及克服措施，以期为今后牡丹育种工作者提供参考，进而加速牡丹育种进程。

1 牡丹远缘杂交育种现状

1.1 牡丹亚组间远缘杂交

牡丹亚组间远缘杂交最早在法国开展，肉质花盘亚组紫牡丹和黄牡丹野生种在欧美牡丹杂交育种中起了重要作用。黄牡丹在法国引种成功后，Henry[4]用中国栽培品种与它杂交，培育出世界上第一个黄色杂种牡丹‘Mm.Louis Henry’，同时期，Lemoine[4]在法国南锡也用滇牡丹（紫牡丹、黄牡丹、狭叶牡丹的统称）和中国牡丹栽培品种间开展类似杂交，并在1900年前后培育出11 个亚组间杂种品种，后被称为Lemoine 系（P.lemoinei）。Lemoine 系牡丹亚组间杂种具有黄牡丹纯正的黄色，同时又具有中国传统品种重瓣、垂头和藏花等性状。20世纪初，美国Saunders[4]用从英国引入的肉质花盘亚组滇牡丹与结实性较强的日本牡丹（P.suffruticosa Japan Group）单瓣、半重瓣类型杂交，所得F1 代杂种花色丰富，花型为单瓣或半重瓣，花头直立并高出叶面，克服了Lemoine 系牡丹亚组间杂种的不足。其中最为著名并在世界范围内得到广泛推广的有含滇牡丹基因‘中国龙’、‘黑海盗’、‘金色年华’和‘海黄’等[5]。后来美国育种家Daphnis[4]也开展了大量类似工作，以Saunders 培育品种为基础通过回交手段培育出亚组间新品种50 多个，这类品种的观赏品质也得到显著提高。欧美品种群牡丹品种类型多为亚组间杂种，此类品种特异性突出、观赏性强。

20世纪90年代末，伴随欧美品种的引进，中国肉质花盘亚组野生种资源挖掘、保护工作得到高度重视，中国牡丹育种工作者，开始着手利用野生种质资源开展亚组间远缘杂交工作。目前甘肃省林业科技推广总站、中国芍药科植物野生种迁地保护课题组、洛阳农林科学院和陈德忠等[6-9]科研单位或个人在牡丹亚组间新品种培育方面已取得突破，陆续公布不少牡丹亚组间杂交新品种，但是育种过程中杂交不亲和及胚败育现象普遍存在。

当前世界范围内流行的亚组间牡丹品种多为紫牡丹和黄牡丹参与杂交形成的品种类型，尽管后来大花黄牡丹也曾用于同普通栽培品种的杂交，但此类亚组间杂种未见流行；狭叶牡丹更是未见有杂交育种成功的报道。可见大花黄牡丹、狭叶牡丹同革质花盘亚组牡丹杂交过程中，杂交障碍问题更为严重，其育种潜力有待进一步挖掘。

1.2 芍药属组间远缘杂交

芍药科芍药属只有牡丹组、芍药组及北美芍药组3 类植物，但它们在生长习性方面差别显著，芍药组植物为草本类型，而牡丹组植物为木本灌木，因此在牡丹组和芍药组植物间杂交取得成功曾被认为是不可实现的梦[10]。因此牡丹组与芍药组组间杂交的成功是芍药属植物一个非常富有创新性的突破成就，在整个牡丹育种界引起轰动，这种类型的开展由日本育种家伊藤（Toichi Itoh）率先缔造，后来在美国广为发展。以纪念日本这位首开牡丹组间杂交先河的育种家，将其及后来由芍药和牡丹杂交形成的组间杂种命名为Itoh杂种。

Itoh 杂种将牡丹和芍药的性状进行了充分结合，根系与牡丹高度相似，但冬季地上茎秆大部分干枯，仅在植株茎基部保留少量木质化并形成花芽，更似芍药草本植物性状。叶裂似牡丹，但质地更接近芍药。Itoh杂种整体植株优美，茎干挺拔，花色丰富，枝叶繁茂，杂种优势突出，抗性强[11,12]。花期恰好介于牡丹和芍药之间，极具观赏和推广价值。

芍药属组间杂交类型分为3 种，即‘芍药牡丹’；‘牡丹芍药’；‘牡丹、芍药北美芍药’或其反交。目前市场上广为流行的Itoh 杂种都为‘芍药牡丹’（正交）的后代，并且个别材料之间杂交亲和性较高，如以‘Martha Washington’‘Golden Era’、‘Martha Washington’‘Smith’s Yellow’、‘Kakoden’‘Alice Harding’等组合培育的Itoh 杂种数量占40%以上[13,14]。而‘牡丹芍药’、‘牡丹北美芍药’或其反交杂交类型，仅有获取杂交种或极少量发芽种苗的报道，但未有杂交种登录。

中国芍药属组间育种工作起步较晚。2008年证实中科院植物研究所刘政安博士发现的‘和谐’为我国首例牡丹、芍药组间杂种[15]。后来北京林业大学成仿云教授牡丹课题组、洛阳国家牡丹园牡丹育种团队等在Itoh杂种品种培育方面均有突破，先后培育出‘京华高静’、‘京华朝霞’、‘京桂美’、‘京俊美’、‘河洛锦绣’和‘洛神奇花’等品种。但在组合设置及亲本材料选择方面仍缺乏创新，品种的培育仍局限于特定组合或亲本材料，创新性组间杂交材料的挖掘及杂交障碍问题破解依然没得到有效解决。

2 牡丹远缘杂交常见障碍机理分析

2.1 远缘杂交不亲和表现

2.1.1 花粉萌发障碍花粉和柱头相互作用识别过程发生障碍是杂交不亲和的首要原因，当遗传距离比较远的花粉落在花朵柱头上后，因花粉与柱头形态学上不匹配以及花柱细胞和柱头的物理、化学性质，柱头乳突细胞产生胼胝质，导致花粉不具备萌发条件而被雌蕊拒绝[16]。另外杂交如果不在母本柱头可授期内进行，因缺乏母本柱头黏液刺激，也可能导致父本花粉不能萌发。

2.1.2 花粉管生长障碍杂交不亲和的植物属种授粉后个别组合类型花粉能够正常萌发，但柱头、花柱细胞往往产生较多胼胝质而抑制花粉管的正常生长，主要表现在萌发的花粉管在柱头或花柱内发生扭曲、缠绕和分叉等异常现象，最终导致花粉管无法到达胚珠完成受精作用[17]。研究表明，黄牡丹与芍药栽培品种杂交及芍药‘粉玉奴’与牡丹‘凤丹白’杂交试验中，授粉后，父本花粉可在柱头上萌发，由于柱头胼胝质的产生，导致大部分花粉管生长缓慢且异常，仅有少数花粉管进入柱头，但不能有效进入子房完成受精[18,19]。可见花粉管生长异常、受阻在牡丹远缘杂交过程中比较常见，是母本柱头和花粉识别不畅通的重要表现。

2.1.3 精卵融合障碍远缘杂交过程中，部分花粉能够正常萌发，并且花粉管能够达到胚珠释放精子，但是释放的精细胞不能和卵细胞或中央极核完成融合形成正常合子，造成假受精或不受精，从而造成在种子发育过程中无正常胚或胚乳的现象。

2.2 牡丹远缘杂交杂种不育性的表现

2.2.1 幼胚不能正常发育芍药属植物胚根据发育进程分为原胚阶段、器官分化阶段与生长成熟阶段，原胚阶段根据发育程度逐渐经历游离核、细胞化以及胚原基发生和球形原胚等时期。核型胚乳的发育进程同样需要经历游离核、细胞化及生长成熟3 个连续的发育阶段。远缘杂交过程中往往由于亲本材料遗传差异较大，常常引起受精或幼胚细胞分裂异常现象造成胚或胚乳不能正常发育[20]。胚及胚乳发育过程中任何环节出现问题以及胚、胚乳及母体组织出现发育不协调等现象，都将造成种胚败育或幼胚早夭现象。在‘凤丹白’‘川赤芍’杂交实验中，研究发现杂种胚发育过程主要停留在游离核至细胞化阶段，同时胚乳游离核分裂能力很差，大部分胚乳游离核数目达到10～20 个即停止分裂并逐渐解体，导致正常胚乳的形成极其缓慢，造成杂种原胚因缺乏营养物质而不能正常发育，从而导致杂种胚早期解体[21]。

2.2.2 杂种不能萌发或发芽后死亡远缘杂交杂种幼胚、胚乳和母本子房组织之间经常出现发育不协调问题，特别是胚乳发育不正常，导致幼胚发育缺乏营养，使杂种胚部分或全部坏死[22-24]，另外有些杂种在没有充分成熟而母本果荚提前开裂，这种情况下有些杂交类型虽能得到含杂种胚的种子，但种子往往不能发芽，或者即便发芽，在苗期也会多数死亡。试验中发现，牡丹远缘杂交部分组合能够收到不少外观正常的种子，但是播种后发芽率低或萌芽后死亡现象严重，其主要原因是种子在发育过程中，胚珠外珠被和内珠被正常发育为外种皮和内种皮，而胚乳、胚的发育早期停止导致种子为空心种子，少数相对饱满的种子由于胚后期分化不完全而不能萌发，个别种子萌发后由于胚乳营养供应不够而早期死亡，只有极少数胚乳、胚发育正常且协调的种子能够正常萌发成为杂种苗。

2.2.3 远缘杂种F1 代植株高度不育牡丹组间及亚组间杂种植株具备形态正常的雌雄蕊结构，但均表现高度不育，极大地限制了其性状的进一步改良[25,26]。植物细胞减数分裂过程中的染色体行为是影响配子形成和育性的关键[27]。染色体的异常行为在牡丹亚组间杂种减数分裂过程中十分普遍，较野生种和亚组内杂种牡丹更复杂，是造成亚组间杂种不能产生正常配子的重要原因。通过对亚组间远缘杂种‘海黄’细胞减数分裂的观察，发现在减I中期单价体和多价体普遍存在，造成大多数细胞中的同源染色体不能准确地分配到两极，另外减I 和减II 中有大量染色体桥和断片的存在，使细胞减数分裂过程不能正常完成而形成可育配子。另外研究中发现同为亚组间杂种的‘梦幻’则为混倍体，其细胞减数分裂中的染色体行为更为混乱、异常，植株呈现完全不育状态[28]。而通过对牡丹芍药组间杂种进行核型分析，研究发现Itoh 杂种为三倍体（2n =3x=15），属2A 型核型[29]。因为三倍体植物在减数分裂联会时通常会形成三价体、单价体甚至是多价体等二价体以外的构型，造成染色体行为异常，从而高度不育[30]。总之，染色体行为异常是造成牡丹远缘杂种高度不育的本质原因。

3 牡丹远缘杂交障碍克服措施

3.1 授精前障碍克服措施

3.1.1 花粉活性保证与母本可授期把握花期不遇是牡丹远缘杂交过程的常见问题，通过花粉贮藏能够有效解决杂交亲本材料之间花期不育问题[31]，确保贮藏花粉具有较高活力是开展杂交工作的前提。温度和花粉含水量是影响花粉储藏时间和活力的重要因素，一般在超低温环境下，干燥的牡丹花粉寿命可保持2年以上[32,33]。但在 18 ℃和 20 ℃环境贮藏是解决牡丹杂交育种花期不遇最经济有效的方法[34]。在授粉时要对贮藏的花粉进行必要的活力测定试验，同时对母本植株进行可授性试验，确保拥有较高活力的花粉在牡丹柱头黏液分泌期内实施授粉是解决杂交不亲和的首要环节。

3.1.2 创造花粉在母本柱头萌发环境花粉萌发及生长条件的营造也能有效促进杂交亲和性。通常通过对母本柱头涂抹激素或其他化学溶液，模拟成熟柱头黏液分泌过程，创造花粉萌发、生长环境，减少花粉萌发环节障碍，提高父母本之间杂交亲和性。试验表明，授粉前用KCl（3.5%）和赤霉素（GA3:25 mg/L）或合适浓度的硼酸、蔗糖溶液处理柱头有利于提高牡丹杂交结实率[35,36]。

3.1.3 积极探索适宜授粉方式蒙导授粉、重复授粉、蕾期授粉和延迟授粉等授粉方式常被用作克服远缘杂交不亲和的有效手段[37,38]。在牡丹远缘杂交过程中，要针对组合配置情况，探索最佳授粉方式，有效提高杂交亲和性。在‘粉玉奴凤丹白’、‘粉玉奴洛阳红’杂交实验中，采用重复授粉、蒙导授粉和延迟授粉的效果均优于常规授粉，在花粉萌发量、花粉管伸长及单花结实率方面延迟授粉对于克服受精前障碍效果最佳，为最佳授粉方式[39]。但不同品种个体间差异显著，因此在牡丹远缘杂交育种中，针对组合设置类型，探索最适宜授粉方式，能够减弱甚至克服母本柱头或花柱对异源花粉萌发及花粉管生长的抑制，提高育种效率。

3.1.4 尝试柱头切割、移植及花粉注射措施在远缘杂交过程中，亲缘关系较远的种属杂交时，常常由于花粉及柱头识别不畅通造成柱头或花柱大量胼胝质产生导致杂交不亲和，切割柱头法能够有效回避花粉柱头识别环节障碍，研究表明，切割柱头授粉法在细叶百合和亚洲百合的杂交实验中，能够显著提高杂交亲和性，提高杂交结实率[40,41]。在牡丹与芍药远缘杂交过程中切割柱头授粉后，花粉萌发量虽然较少，但能有效降低胼胝质的产生，有少量花粉管能够穿过柱头伸进子房，表明切割柱头授粉法对于克服受精前障碍有一定的效果[39]。另外柱头移植[42]及花粉和萌发剂混合液子房注入法也要及时进行尝试探索，评价其具体应用效果。

3.2 牡丹远缘杂交不育障碍克服措施

3.2.1 幼胚拯救远缘杂交过程中，部分杂交类型能够克服受精前各种障碍完成授精作用，精卵细胞正常融合形成合子后，合子即开始有丝分裂发育形成胚，初生胚乳核发育形成胚乳，同时胚、胚乳及母本子房组织发育协调，最终形成功能正常的可萌发种子[43]。但远缘杂交杂种在发育过程中，往往由于杂种幼胚、胚乳组织或母体组织之间发育不协调等因素常引起胚降解、败育或杂种不育现象，这种杂种不能正常发育所引起的杂种崩溃现象均为受精后障碍，受精后障碍是导致远缘杂交失败的关键因素。

能够通过胚拯救措施对幼胚发育早期败育或杂种胚无法播种成苗等问题进行有效克服。幼胚拯救用于解决远缘杂交育种受精后障碍问题已经在蔬菜、花卉和果树等领域得到广泛应用[44-46]。通常情况下，根据培养对象不同，胚拯救主要通过幼胚培养、胚珠培养和子房培养实现，另外幼胚发育不同阶段进行离体培养拯救的措施和成功率差别很大[47]。牡丹远缘杂交胚拯救难易程度同样与胚龄关系密切，处于发育阶段初期的幼胚对环境和营养条件要求很严格，幼胚自身完全处于异养状态，培养成功率很低。但培养措施太晚，幼胚可能已经发生降解，同样不易培养成功，因此幼胚降解临界点是进行胚拯救的最佳时期[45]。律春燕[14]采用子房培养的方式将亚组间杂交类型母本子房置于含有0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA 的MS 培养基上培养，受精后障碍得到有效地克服，并且筛选出适宜的生根培养基。贺丹等[48]通过对芍药‘粉玉奴’与牡丹‘凤丹’的杂种胚珠进行培养进一步发现胚龄及对应培养基类型是影响胚拯救成功率的重要因素。可见，胚拯救的成败不仅与胚龄密切相关，同样与对应时期的培养基激素组合密切相关。目前在牡丹杂交育种工作中，胚培养技术体系尚不成熟完善，幼胚继代培养褐化现象的解决及合理培养基、激素的搭配选择等还需进一步研究，一套成熟的牡丹胚拯救技术体系还需进一步深入研究。

3.2.2 染色体加倍恢复远缘杂种育性通过杂交措施获得的远缘二倍体杂种，由于杂交过程中亲本遗传差异显著，在细胞减数分裂时染色体异常行为普遍，无法产生正常配子，导致杂种不育[49]。对于这种情况，可尝试通过秋水仙素处理杂种幼苗或成年植株芽体，使细胞染色体数加倍成为异源四倍体（即双二倍体），解决细胞减数分裂中同源染色体无法配对联会现象，从而产生正常配子，恢复自身育性[50-52]。今后通过染色体加倍措施使牡丹亚组间杂种或组间杂种育性得到有效恢复，并进一步挖掘利用其育种价值将是牡丹新品种培育取得进展的重要突破手段。

4 展望

中国在芍药属植物远缘杂交育种方面起步较晚，取得的成就较欧美、日本等国差距甚远，目前远缘杂交机制研究方面还比较肤浅，研究方法和技术手段比较单一，许多野生种和优良品种资源没有得到充分利用，在远缘杂交不亲和障碍机制及杂种不育方面研究缺乏具有可操作性的突破成就。近缘杂交在牡丹品种创新方面已很难突破，在未来育种工作中要坚持不懈地开展组间、亚组间远缘杂交，同时要积极开展杂交机理研究，积累技术经验，突破杂交不亲和及杂种不育难题，建议加强做好如下工作：

4.1 加强种质资源保护，探索亲和性好的组间及亚组间亲本材料

中国是公认的芍药属植物资源分布和栽培中心，尤其牡丹组野生种均原产中国，其中紫牡丹、黄牡丹引到国外被广泛用于杂交育种，培育出大批亚组间牡丹新品种。另外国际上Itoh 杂种的培育还仅仅局限于个别材料或组合类型，因此今后要重视国内种质资源的收集、保护工作，尤其针对珍稀野生资源要尽快建立迁地保护圃，同时收集国外组间及亚组间品种类型，在此基础上加强各类资源的研究和综合利用，借鉴国内外远缘杂交成功经验，探索新的组间、亚组间杂交创新资源材料。

4.2 探索恢复亚组间杂种及Itoh杂种的育性

通常情况下牡丹亚组间杂种和Itoh 杂种由于染色体异常问题而表现高度不育，但是也存在获得正常种子的微小概率，我们在育种工作中要用心去把握牡丹远缘杂种结实的微小几率获得F2 代植株，并充分挖掘利用F2 代植株育种价值[53]。另外要积极探索染色体加倍育种技术的利用，通过秋水仙素处理措施使远缘杂种植株染色体加倍，从而克服杂种不育问题，充分挖掘亚组间杂种及Itoh 杂种三倍体的育种潜能。