HPLC法测定血平片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量研究

2022-12-09刘厚权林飞英肖忠训何虎冰胡吉忠夏淑英周朝忠肖绍川康兴东

特产研究 2022年5期

刘厚权，林飞英，肖忠训，何虎冰，胡吉忠，夏淑英，周朝忠，肖绍川，康兴东

（江西普正制药股份有限公司，江西吉安 343100）

血平片由地黄、熟大黄、地榆、三七、海螵蛸、茜草和炒蒲黄等7 味药材组成，具有清热化瘀、止血调经的功效，临床用于治疗因血热挟瘀所致的崩漏[1]。血平片处方中7 味药材均具有止血的功效，现行质量标准中仅采用HPLC 测定大黄素和大黄酚的含量，显然不利于保障血平片产品品质，尤其是三七作为血平片处方中唯一的贵重药材，理应建立其含量测定方法。罗汉宇等[2]建立了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1总含量的HPLC 检测方法，但其供试品溶液制备方法比较繁琐，不利于检验操作。《中国药典》2020年版一部[3]中三七药材是采用HPLC 测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三者的总含量；珍黄胶囊[4]、脑脉泰胶囊[5]、活血止痛胶囊[6]、滇女金丸[7]和虎力散片[8]等含有三七的中成药制剂也均采用HPLC法测定其中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量，可以较好地保障产品品质。故本研究选择三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1为指标成分，采用HPLC 法建立了对血平片中三七的含量测定方法。该方法简便易行，可以有效控制该制剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备

Waters 2695 型高效液相色谱仪（含自动进样器、PDA 检测器）；AUW220D 十万分之一电子分析天平（日本岛津公司）；AB104-N 万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；

HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；Mili-Q 超纯水仪（美国Milipore 公司）；SHB-IV 循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试剂与试药

三七皂苷R1对照品（批号：110745-201318，质量分数94.0%）、人参皂苷Rg1对照品（110703-201128，质量分数93.4%）、人参皂苷Rb1对照品（110704-201223，质量分数95.9%）均由中国药品生物制品检定研究院提供；乙腈（色谱纯）、甲醇（分析纯）、正丁醇（分析纯）、氨试液（分析纯）、乙醇（分析纯）、水均来自自制超纯水。血平片共10 批（江西普正制药有限公司，批号分别为：171101、171102、171201、171202、180101、180401、180402、180901、180902、181001，规格：每片重0.3 g）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为安捷伦C1（8250 mm 4.6 mm，5m）色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动性B，梯度洗脱（0～20 min，A：20%；20～75 min，A：20%～32%）；流速为1.0mL/min；检测波长200nm，柱温30℃；进样量10L。

2.2 不含三七的阴性样品溶液的制备

取大黄150 g，粉碎成粗粉，与450 g地黄混合，加80%乙醇6 倍量，加热回流提取2 次，每次1 h，合并乙醇提取液，滤过，滤液备用。药渣与其他中药地榆、海螵蛸、茜草和蒲黄（炒）加水煎煮3 次，每次1h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为的1.10～1.15（60 ℃）清膏，加入乙醇使含醇量达50%，搅匀，冷藏，取上清液与上述醇提液合并，减压回收乙醇，并浓缩成相对密度为1.25～1.30（60 ℃）清膏，80 ℃干燥，粉碎成细粉，加入淀粉55 g，混匀，制粒，干燥，加入硬脂酸镁2 g，混匀，即得。

2.3 对照品溶液制备

精密称取三七皂苷R1对照品4.15 mg，人参皂苷Rb1对照品4.77 mg、人参皂苷Rg1对照品4.27 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.4 血平片样品溶液制备方法

取本品20 片，除去薄膜衣，研细，精密称定1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50 mL，称重，回流提取2 h，取出，放冷，用水饱和的正丁醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25mL，置分液漏斗中，用氨试液25 mL 洗涤1 次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至25mL，摇匀，滤过，即得。

2.5 系统适应性试验

取血平片样品、阴性样品，分别按“2.4”项下制备方法制得供试品溶液及阴性对照溶液，精密量取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10L 注入液相色谱仪，结果见图1；结果显示，在供试品溶液色谱图中，与三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1色谱峰相应的位置上有色谱峰，且阴性样品无干扰。

图1 混合标准品（A）、供试品（B）和阴性对照品（C）色谱图Fig.1 The chromatograms of the mix standard (A)、spmples (B) and the negative control (C)

2.6 线性关系考察

取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rg1对照品，分别制成不同浓度，取10L注入液相色谱仪，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，三七皂苷R1 在10.38～332.12g/mL范围内，峰面积与对照品浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程y=2 904 700x 7 487.06，R2=0.999 9；人参皂苷Rg1 在11.93～381.89g/mL 范围内，峰面积与对照品浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程y=3 190 827x 5 294.24，R2=0.999 8，人参皂苷Rg1在10.69～342.20g/mL 范围内，峰面积与对照品浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程y=2 946 742x-913.07，R2=0.999 9。

2.7 精密度试验

取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg1混合对照品溶液连续进样6 次，每次吸取10L 注入液相色谱仪，记录峰面积。求得三七皂苷R1 峰面积的RSD值为3.27%，人参皂苷Rg1峰面积的RSD值为2.64%，人参皂苷Rb1峰面积的RSD 值为4.03%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

精密称取同一批血平片样品1.0 g（181001 批，6份），按供试品溶液制备方法制备，每次吸取10L，注入HPLC 仪器中进行测定，计算含量。结果表明，本品中三七皂苷R1含量平均值为0.23 mg/片，RSD 值为5.04%；人参皂苷Rg1含量平均值为0.75 mg/片，RSD值为1.36%；人参皂苷Rb1含量平均值为1.85 mg/片，RSD 值为0.93%。

2.9 稳定性试验

精密吸取同一份血平片供试品溶液，于0 h、2 h、4 h、12 h、18 h 和24 h 进样，测定峰面积，得到三七皂苷R1峰面积的RSD 值为3.24%，人参皂苷Rg1峰面积的RSD 值为2.62%，人参皂苷Rb1峰面积的RSD值为4.00%，表明血平片供试品溶液在24 h 内稳定。

2.10 加样回收率试验

精密称取血平片样品（6 份），分别加入三七皂苷R1对照品1.22 mg、人参皂苷Rg1对照品10.29 mg、人参皂苷Rb1对照品3.53 mg，按“2.4”项下制备方法制得供试品溶液，每次吸取10L，注入HPLC 仪器中进行测定，其结果见表1。结果显示，三七皂苷R1的平均回收率为97.7%，RSD 值为3.18%；人参皂苷Rg1的平均回收率为98.6%，RSD 值为0.55%；人参皂苷Rg1的平均回收率为100.4%，RSD 值为1.82%。表明该测定方法偏差较小，回收率良好。