NHE1生物学功能的研究进展

王岩，赵蒙，魏倩倩，唐毓，张颖，杨镒峰，许保增

（中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室，吉林 长春 130112）

钠氢交换蛋白（NHE）主要通过细胞外的Na+交换细胞内H+来调节细胞内pH 和细胞体积，是一种在哺乳动物细胞中广泛表达的整合膜蛋白[1]。NHE 有10个亚型，分别命名为NHE1～NHE10，它们共同构成膜交换蛋白基因家族，每种亚型代表不同的基因产物，具有独特的组织表达、膜定位、生理效应及对药物抑制剂的敏感性。其中，NHE1 是首个被发现的亚型，通常被称为NHEs 家族的“管家”亚型，在很多组织细胞质膜中都表达，它通过离子交换维持细胞内pH 的稳定，可调节细胞体积、细胞内的渗透压及维持细胞骨架结构，并且对细胞生长、增殖、分化、细胞迁移和凋亡等有影响，同时，NHE1 在人的病理过程中也扮演着重要角色，在肿瘤、癌症、人的心肌梗死及心血管疾病中也发挥重要作用。NHE1 有两个结构域，包括N 端的膜结构域和C 端的胞质调节结构域，调节其活性。NHE1通过ERM、磷脂酰肌醇三激酶和Akt等信号通路恢复细胞骨架。NHE1 参与细胞的分化、增殖和凋亡，当NHE1 缺失或抑制时，将损坏分化途径。在几类质子通量交换剂中，Na+/H+和HCO3-/Cl-交换剂可调节细胞内的pH 和细胞体积，并对细胞骨架结构及卵母细胞减数分裂过程有影响。本文对NHE1 及其家族成员的分子特性、细胞内pH 调节、细胞体积调节、卵母细胞骨架结构的影响和NHE1 在卵母细胞减数分裂及植入前胚胎的作用进行综述。

1 NHE1 及其家族成员的分子特性

钠氢交换蛋白有10 个亚型，它们共同构成膜交换蛋白基因家族，其中NHE1 在家族中是比较重要的亚型，参与很多生理过程，在调节细胞体积、细胞内pH、细胞骨架、心脏病、癌症和信号分子中起关键的作用。NHE1 对细胞的生长、增殖、分化、凋亡及调节细胞黏附、细胞形状和细胞迁移的影响，主要是通过维持细胞内pH 的稳定，调节细胞内的渗透压和细胞体积来发挥作用[2-4]。

NHE1 在家族中常被称为“管家基因”，它几乎在所有组织的质膜上都有表达，参与体内平衡、细胞体积调节和生长因子对细胞增殖的反应。NHE1 是在细胞膜上广泛表达的膜蛋白，通过交换细胞内的氢离子和细胞外的钠离子，维持细胞内pH和细胞体积。当NHE1在肿瘤酸性微环境时，影响肿瘤的发生、迁移、基质降解和血管生成等。NHE2～NHE5 主要在质膜上表达，调节细胞质pH、细胞的容积和细胞内液的分泌，是通过与碳酸氢盐转运蛋白协同后起到作用[5]。NHE2和NHE4在胃和肠道上皮细胞的顶端膜上表达，NHE2 参与Na+重吸收，主要在胃和肠道中表达量较高，可能与NHE4共同作用[6]。NHE3 不仅在肾小管近端上皮的顶膜和肠上皮边缘膜表达，大部分还在循环胞浆内质膜的小囊泡中表达[7]。NHE4 主要在胃上皮、肾内髓质和海马中表达。NHE5 主要在大脑上表达，在非上皮组织中也表达，如脾脏、睾丸和骨骼肌中[8]。NHE6～NHE9 主要在细胞器（内膜）膜上表达，参与细胞器内pH 和离子浓度的调节，不仅能转运细胞外的Na+和Li+，还可以转运K+[9]。NHE6 主要在心脏、大脑和骨骼肌中表达，以及在早期循环的核内体和线粒体中表达。NHE7 在反式高尔基体网络中表达。NHE8 在反式高尔基体的中间表达。NHE9 在晚期恢复的核内体中表达，与精神疾病及各种癌症相关，其通过核内体调节功能和蛋白间相互作用而发挥作用[10-12]。NHE10 主要在破骨细胞中高表达。

NHE1 是由N 端的膜结构域（疏水结构域）和C端的胞质调节结构域（亲水结构域）的12 个跨膜段组成，由815 个氨基酸残基组成，N 端的膜结构域是由第1～500 氨基酸残基组成，参与细胞外的Na+和细胞内的H+的交换。C端的胞质调节结构域是由第501～815氨基酸残基组成，并介导细胞骨架相互作用，它包括CaM、CHP 和ERM 等蛋白结合位点以及胞质结构域参与磷酸化和活性调节的区域。当CaM 与NHE1 结合时，CaM消除了自我抑制，激活了NHE1 的活性，当CHP 和ERM 在胞质调节尾结合，使NHE1 参与生理活动（见图1）[12]，因此C 端的胞质调节结构域对调节钠氢交换剂活性起着重要作用[13]。NHE1 的功能活性主要是通过跨膜区6（TM6）、跨膜区7（TM7）与第242位氨基酸和260 位氨基酸的紧密联系发挥活性，当两种氨基酸分别发生突变时，NHE1 的活性丧失，而这两种氨基酸同时突变时，NHE1 的活性不发生变化。有研究表明，NHE1 的12 个跨膜片段中，有3 个膜相关的环区IL2（胞内环2）、IL4 和EL5（胞外环5），这些氨基酸残基的突变导致细胞内NHE1 敏感性发生改变，参与胞内质子变构反应的形成。

图1 NHE1 结构[14]Fig.1 Structure of NHE1[14]

2 NHE1 单独激活调控细胞pH 的生物学作用机制

Na+/H+交换蛋白NHE1 在很多生理过程中起到核心作用，其功能是将细胞内的H+交换成细胞外的Na+，进而调控细胞内的pH，改变细胞的生长或者功能状态。NHE1 交换剂在细胞内pH 调节有Na+/H+交换泵、Na+/HCO3-共同转运交换器、H+/ATP 酶交换器、H+-乳酸交换器和Na+独立的Cl-/HCO3-交换泵等5 种途径，其中Na+/H+交换泵起主要作用。NHE1 参与细胞内信号通路介导发挥作用，主要有蛋白激酶C、p42/44 促分裂原活化蛋白激酶通路，它们直接磷酸化NHE1 或者通过结合NHE1 的中间蛋白起作用。

细胞内pH（pHi）在6.9～7.2 正常生理范围内，对维持细胞的正常生理功能很重要，pHi 的变化可能会影响蛋白质、离子通道、细胞增殖、分裂和细胞生长分化的速度以及胞内酶活性等生理过程的正常功能以及细胞骨架的相互整合，因此保持细胞内正常的pH 非常重要[14]。NHE1 可以保护细胞免受酸化，当细胞内pH降低时，NHE1 被激活，在发生酸中毒时，蛋白质的活性增加进行补偿，使细胞内的pH 值提高到正常值。在各种细胞类型中，NHE 是Na+主要途径，NHE1 通过渗透收缩调节钠通量和细胞体积，进而保护细胞免受细胞内酸化[15]。当细胞处于高渗透压溶液中时，NHE1活性增加，导致细胞液呈碱性，这一反应包括细胞体积增加，补偿了由外部高渗引起的收缩[16]。有研究表明，在细胞受到刺激后，胞内pH 下降，导致NHE1 被激活，使Na+和H+出现交换作用[17]。NHE1 在一些复杂的病理过程中，由于在缺氧和缺血的情况下，细胞内ATP酶不足，导致细胞内的Na+不能交换到细胞外，使细胞内的Na+含量增加。NHEl 的激活以及基因表达增加与血管平滑肌细胞、心肌肥厚增殖有关，通过双向性Na+/Ca2+交换机制使细胞内Ca2+浓度升高，细胞内的Ca2+不断累积，可引发血管平滑肌细胞增殖与肥大，因此高盐诱导下的血管平滑肌细胞随着细胞外Na+浓度升高，导致Na+/H+交换增强，进而NHE1 激活使细胞内pH 升高，可能是高盐诱导血管平滑肌细胞发生表型转化、增殖导致血管重构的一个重要因素。细胞内Na+浓度的增加，激活了Na+和Ca+逆向转运，使细胞中Ca+浓度不断积累，引发各种细胞信号转导途径，导致细胞死亡[18-20]。细胞在有丝分裂过程中刺激NHE1 交换蛋白表达量增加，其表达增加有助于细胞生长过程中细胞内pH 的升高和维持[21]。NHE1 蛋白的基因表达水平和产量受NHE1 启动子的影响，而细胞中NHE1 蛋白的量影响离子交换的速度，因此在许多环境的刺激下，影响Slc9a1 基因mRNA 水平的表达量、蛋白表达量及钠氢交换剂的活性[19,22]。

NHE1 对肿瘤生长很重要，在很多类型恶性肿瘤细胞中，NHE1 引起了细胞内pH 梯度的逆转，使肿瘤细胞内环境是碱性的，细胞外环境是酸性的，与正常细胞相反[23]，NHE1 也是癌症转化的关键步骤，在一些未转化的细胞类型中，肿瘤微环境可激活该蛋白，在一些乳腺癌细胞中，血清缺失是一种常见的肿瘤微环境条件，这导致该细胞类型的NHE1 异常激活。NHE1 激活被证明是由肿瘤细胞特异性的RhoA 和Rac1 的作用介导的。在癌细胞中，血清缺失会抑制伪足前缘的RhoA活性，而在非肿瘤细胞中则不会发生这种情况[23,24]。

3 NHE1 偶联HCO3-/Cl-交换通道对细胞体积的调节机制

钠是NHE1 偶联阳离子，具有渗透活性，对调节细胞体积至关重要[22]，当细胞收缩时NHE1 活性被激活，细胞膨胀时NHE1 活性被抑制，细胞收缩或者膨胀可能导致细胞膜和细胞骨架结构完整性被破坏[25-27]。细胞体积的调节对细胞活力的影响很重要，哺乳动物体细胞通过无机离子运输到细胞质中来纠正急性细胞体积减少，当细胞体积减少时，通过无机渗透压调节通道Na+/H+交换剂NHE1 与HCO3-/Cl-交换剂偶联快速恢复机制，当Na+和Cl-进入到细胞，增加了细胞内渗透压，使细胞恢复正常大小，由于细胞质的离子增多，使一些细胞累积出渗透压的能力，通过特定的转运体来取代无机离子的一部分，但仍然保持细胞内的渗透性（图2）。细胞体积的减少激活了NHE 家族Na+/H+交换活性，使NHE1 在调节细胞体积时，排出去的H+在细胞内缓冲液中再生，导致细胞内活性渗透压增加。NHE1 激活是因为细胞体积减少引起，而不是因为渗透压的关系，尽管细胞体积的改变激活了很多激酶，但磷酸化后不会因细胞的收缩而发生很大改变。当细胞体积减少时，在大多数哺乳动物体细胞的最初急性恢复是通过Na+/H+和HCO3-/Cl-交换剂的功能偶联，而快速输入无机离子来介导[14]。细胞体积减少，激活了NHE1 的Na+/H+交换活性，当Na+输入细胞、H+输出细胞，两个离子进行交换时，使细胞内pH 升高。相反的，激活了Slc4 家族的HCO3-/Cl-交换活性，当HCO3-输入到细胞、H+输出细胞时，细胞内pH降低，进而Na+和Cl-偶联，增加了细胞内的渗透压，并恢复了细胞体积。因此细胞内pH 在正常的生理范围，对维持细胞骨架组装和解聚、生长分化及细胞内酶的活性等生理过程十分重要。Slc9 基因家族的Na+/H+交换剂和Slc4 基因家族HCO3-/Cl-交换剂在哺乳动物的细胞体积调节和细胞内pH 稳态中发挥作用[27,28]。当细胞在高渗培养液中时，细胞收缩会触发细胞体积调节增加，并刺激Cl-/HCO3-交换体，Na+/K+/2Cl-共转运体和Na+/H+交换体共同激活，在细胞内产生NaCl。钾离子被钠、钾三磷酸腺苷酶泵交换为细胞内钠离子，最终导致细胞KCl吸收（见图3）。

图2 细胞体积调节机制[29]Fig.2 Mechanism of the cell volume regulation[29]

图3 细胞收缩转运蛋白调节过程[14]Fig.3 Regulation of various transporters on the membrane during cell contraction[14]

4 NHE1 作为脚手架蛋白调控细胞骨架组装的分子机制

NHE1 通过影响细胞体积、调节细胞内酸碱度进而调节细胞体积骨架元素的组装和活性。NHE1 作为肌动蛋白丝的浆膜锚定蛋白的一种功能蛋白，独立于离子转运发生，是细胞黏附和皮层肌动蛋白丝动态重组的重要决定因素，参与细胞骨架锚定，该蛋白质大约由315 个氨基酸组成C 端的膜结构域调控蛋白质，介导参与调节细胞骨架组织，控制细胞质的完整性，对细胞黏附到细胞外基质蛋白和细胞迁移起重要作用，但这种结构作用与它作为离子交换器功能无关。

NHE1 作用于整合素受体和RhoGTPases的下游，调节细胞骨架事件，包括细胞黏附、细胞形状以及肌动蛋白丝的组装，NHE1 的肌动蛋白锚定功能，不是它在离子转运中的功能，而是皮质细胞骨架响应细胞外信号的动态重组。在RhoA 通路中，NHE1 作用于G 蛋白偶联受体和整合素受体的下游，来调节细胞骨架组织、局灶粘连的组装、肌动蛋白应激纤维的形成和细胞形状[24,30]，当NHE 缺失会损害细胞骨架组织。在某些细胞中，NHE1 局限于特殊的膜结构，细胞形状不规则，在划痕试验中，细胞的迁移能力受到严重损害[31,32]。NHE1 在细胞迁移中起主要作用，细胞迁移可能与细胞体积调节、细胞骨架稳定性和质膜锚定有关，并且细胞的迁移依赖于定向细胞骨架的重组[33,34]。NHE1 调节细胞骨架组织和细胞形状的能力独立于离子转移，NHE 活性和pH 的变化基于pH 依赖的肌动蛋白丝动力学发挥作用。NHE1 除了调节Na+/H+以外，细胞形态和黏附的维持主要是通过肌动蛋白丝与细胞膜的结合，它作为肌动蛋白丝的锚定物，可通过NHE1 细胞质尾部与ERM（ezrin,radixin,moesin）蛋白的相互作用锚定到细胞骨架上（肌动蛋白与质膜交联），这种相互作用调节NHE1 和ERM蛋白在膜突起远端边缘定位，并在调节皮质肌动蛋白丝的组织和细胞形状、黏附、细胞的迁移和对凋亡的抵抗中发挥作用。ERM 被破坏时这些相互作用影响细胞骨架结构、外部黏附和细胞迁移[35-38]。因此NHE1 通过与细胞骨架的相互作用及有限的位置变化在细胞迁移中起着关键作用。

5 NHE1 调控哺乳动物卵母细胞减数分裂及植入前胚胎发育的分子机制

Na+/H+交换剂NHE1 和HCO3-/Cl-交换剂AE2 偶联作用，共同调节哺乳动物细胞体积减少，是细胞体积减少急性恢复的主要机制，而单独作用时，可调节细胞内酸碱度。细胞有丝分裂的刺激与Na+/H+交换蛋白的表达增加有关，这种表达的增加可能有助于细胞生长过程中细胞内pH 的升高和维持[27,39]。在细胞的周期进展和分化过程中NHE1 也起到很重要的作用，可保护细胞免受细胞内酸化[40,41]，并调节钠通量和细胞体积后渗透收缩[42]。当细胞内pH 降低时，NHE1 被激活使细胞内的H+排出交换细胞外Na+，使细胞在酸中毒中恢复。细胞内酸中毒时，刺激NHE1 活性存在于排卵前生发泡期（GVBD）小鼠卵母细胞中，在减数分裂成熟过程中降低。而在生发囊泡（GV）卵母细胞中，细胞体积减少刺激的NHE1 活性较低，但在减数分裂成熟过程中，随着卵母细胞从透明带分离，该活性变得活跃，在成熟卵中，NHE1 活性再次降低。有研究证明，NHE1 在成熟卵母细胞、受精卵和植入前胚胎等哺乳动物细胞中也发挥作用[43-45]，并且NHE1 在卵母细胞成熟过程中表现出复杂的发育变化，将卵母细胞转换成可受精的卵子[46]。对处于发育中小的卵母细胞不能检测到Na+/H+和HCO3-/Cl-交换剂，它们不能独立地调节自身细胞内的pH[51]。而在生长中的卵母细胞pHi受周围卵泡颗粒细胞环境的调节，通过卵母细胞颗粒间隙链接发挥作用[47,48]。在GV 时期的卵母细胞中Na+/H+和HCO3-/Cl-交换剂可调节细胞内pH，在减数分裂成熟过程中，这两种交换剂出现失活现象。HCO3-/Cl-交换活性在排卵后逐渐降低，在成熟的卵母细胞中呈静止状态。在哺乳动物植入前胚胎可以调节细胞内的pH，HCO3-/Cl-交换活性可调节细胞内酸中毒，在小鼠2-cell胚胎阶段中被发现，并在植入前发现1-cell 和2-cell 活性最强[49,50]，而在未受精的排卵小鼠和仓鼠卵中几乎没有HCO3-/Cl-交换活性，当卵被激活后，卵原核形成时，其活性完全被激活。成熟的卵子在受精后几个小时内，交换剂重新被激活，实现细胞内pH调节。综上所述，Na+/H+和HCO3-/Cl-交换剂在GV时期的卵母细胞、1-cell 和2-cell 胚胎中存在，可通过激活两个交换剂活性来调节细胞内的pH[48]。NHE1 交换剂似乎是哺乳动物胚胎中广泛研究的交换剂，在胚胎的所有阶段调节酸中毒，其中在仓鼠和牛的胚胎中活性最强，而在人类的胚泡阶段无法从细胞内pH 的小幅度下降中恢复。有研究发现，小鼠在着床胚胎的所有阶段中，介导Na+/H+交换被激活，使细胞体积减少，事实证明在MII、1-cell 和2-cell 中都存在Na+/H+交换被激活时，会随着卵母细胞减数分裂过程不断降低，而在受精后活性升高[51]。在NHE家族中，NHE1～NHE5是定位于质膜上的Na+/H+交换剂，而其他亚型都定位于细胞内的细胞器中，并且很多亚型都在植入前胚胎（PI）中表达，其中NHE1 的整个转录本在整个PI 胚胎发育过程中被检测到[43]。有研究表明，通过分子技术等研究发现Na+/H+交换基因Slc9a1～Slc9a5 在卵母细胞GV 期和植入前胚胎1-cell、2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚阶段都有表达，其中Na+/H+交换基因Slc9a1、Slc9a3 和Slc9a4 在GV 期、卵子和几个胚胎阶段都有表达。Slc9a1 扩增子在卵母细胞和整个植入前胚胎中都有表达，而Slc9a3 扩增子在GV 期卵母细胞、卵子和单细胞胚胎中可检测到，在二细胞阶段略有发现，而Slc9a4 扩增子似乎存在于GV 期卵母细胞、卵子和单细胞胚胎中[27]。采用免疫荧光技术检测卵母细胞减数分裂和交换剂失活时NHE1 在亚细胞中的定位变化，发现NHE1 在GV期卵母细胞的质膜上表达，并导致NHE1 交换剂活性增加，但仅限于与CHP1 共表达时，当表达功能性NHE1 的卵母细胞成熟后，NHE1 的膜定位和Na+/H+交换剂活性丧失[45]。

6 展望

NHE1 作为一种渗透压调节剂，对细胞骨架有着很重要的影响，在哺乳动物中，细胞骨架对卵母细胞的成熟和受精起关键作用，但目前关于NHE1 对细胞骨架的作用机制尚不明确。随着体外控制技术的不断发展，为保存优良的种质资源，采用超低温冷冻技术保存卵母细胞，在细胞冷冻时采用高浓度的冷冻保护剂使细胞内、外的浓度达到平衡，通过渗透到细胞内的保护剂将大部分的水分置换，使细胞内胞质发生变化，因此在今后的研究中，可着重研究通过调节NHE1 来降低卵母细胞冷冻对细胞骨架的损伤。