恩施地区粉葛不同组织活性成分含量与抑菌活性分析

刘玉，袁名远，郭汉玖，郭杰，李宇*，何美军*，罗凯

（1.湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.湖北省农业科学院中药材研究所，湖北 恩施 445000；3.国家中药材产业技术体系恩施综合试验站，湖北 恩施 445000）

粉葛（Pueraria thomsonii Benth）为豆科葛属多年生藤本蔓生植物，性甘、辛，味凉，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效[1-3]。现代药理学研究表明，粉葛作为多年生药食两用植物，其有效活性成分主要为大豆苷元[4]、葛根素[5]、大豆苷[6]等异黄酮成分，具有改善心脑血管系统[7]、降血糖[8]、抗癌抗炎[9]、解酒护肝[10]等生理作用。粉葛的生长能力强，每公顷产量约为72 000 kg～108 000 kg，淀粉含量高达52%左右，未来有望成为世界第六大粮食作物[11-13]。粉葛加工成的葛粉含有多种维生素、蛋白质、微量元素等，为优良淀粉原料和羹汤糊料[14-15]。

目前粉葛活性成分研究与开发主要集中在根部，而对茎、叶部分的研究较少，造成了粉葛资源的浪费。因此，本文选取从恩施州粉葛产区采集粉葛全株，采用高效液相色谱外标法分别对粉葛根、茎、叶部的葛根素、鹰嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元等4种活性成分的含量进行对比检测分析，测定对11种供试菌的抑菌活性，为粉葛资源的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

粉葛样品：湖北省恩施市三岔乡高山地区（海拔1 000 m～1 300 m）采集，由湖北省农业科学院中药材研究所鉴定；葛根素、鹰嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia ATCC13883）、粪链球菌（Enterococcus faecalis ATCC 29212）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 19659）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus ATCC 4698）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis ATCC 10792）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 43300，MRSA）、多耐铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus ATCC 17749）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis ATCC 12228，MRSE）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC29213）、大肠杆菌（Escherichiacoli ATCC25922）：中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室鉴定提供。

1.1.2 仪器与设备

高速多功能粉碎机（XY-200型）：浙江省永康市松青五金厂；高效液相色谱仪（Agilent 1260配DAD检测器）：安捷伦科技有限公司；冷冻离心机（3K15）：德国西格玛公司；数控超声波清洗器（KQ5200DE）：昆山市超声仪器有限公司；电子天平（FA20048）：上海佑科仪器仪表有限公司；电热鼓风干燥箱（101-4AS）：北京市永光明医疗仪器厂；酶标仪（HF4500）：北京华安麦科生物技术有限公司；培养箱（CR-80CO2）：广州市康恒仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE-200A）：上海爱朗仪器有限公司；超净工作台（SW-CJ-2FD）：上海达平仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 供试液的制备与培养基配制

将粉葛全株洗净除杂，根、茎、叶分别于60℃烘干、粉碎、过50目筛后，各取根、茎、叶2 g加入20 mL甲醇[1∶10（g/mL）]，200 W 超声辅助提取 30 min。取2 mL提取液经12 000 r/min离心15 min后，取上清液过0.45 μm微孔滤膜备用[16]。

LB培养基配制：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2～7.4，121℃灭菌 30 min（固体 LB 培养基加入琼脂20 g/L）。

MH液体培养基配制：牛肉粉2 g/L，可溶性淀粉1.5 g/L，酸水解酪蛋白 17.5 g/L，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌30 min。

1.2.2 混合标准液的制备

分别称取葛根素、鹰嘴豆芽素、大豆苷和大豆苷元4个标准品各10 mg，置于100 mL的容量瓶中，加入甲醇定容，配制成100.00 μg/mL的储备母液。

4个标准品混合标准储备液：分别移取4种标准品储备母液各0.25 mL于同一个5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成4 μg/mL的储备液。

系列标准工作溶液：分别对混合标准储备液进行一系列浓度稀释得到 5、8、10、12、15、18 μg/mL 系列混合标准液备用。

1.2.3 高效液相色谱条件

色谱柱：Phenomenex色谱柱（50 mm×4.6 mm，ODS 5 μm）；Agilent Poroshell反相色谱柱 120 EC-C18（4.6 mm × 150 mm，4 μm）；流动相水（A）、乙腈（B），梯度洗脱：0～20 min，B 0%～ 80%；20 min～27 min，B 80%～100%；27.1 min～30 min，B 0%；流速 1.0 mL/min；检测波长 260、280、360 nm；柱温 30 ℃；进样量 5 μL。

1.2.4 粉葛活性成分高效液相色谱检测

4种标准品葛根素、鹰嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元的线性关系考察，取1.2.2项叙述的稀释系列标准溶液，按1.2.3项叙述的色谱条件进行高效液相色谱检测（high performance liquid chromatography，HPLC）进样上述系列标准溶液，每组样品进样6次重复。参照2020版药典0512通则规定，测定仪器信噪比（S/N），当各标准溶液稀释至信噪比3＜S/N＜10时，以该溶液浓度计算仪器检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），得到4种标准品的标准曲线、R2、检出限和定量限。对各标准品进行精密度和重复性试验，每个混标重复检测6次，计算相对标准偏差。检测加入标量的各样品的4种标准品的含量，计算回收率和相对标准偏差，重复检测6次。HPLC外标法检测4种标准品的含量计算公式如下。

式中：Cx为粉葛中标准品的含量，μg/mL；CR为HPLC检测的含量，μg/mL；m为样品干重，μg。

1.2.5 粉葛不同部位抑菌活性研究

采用滤纸片法[17]测试粉葛不同部位对10株供试菌的抑菌活性，取20 μL培养至OD600为0.6的测试菌菌液，与20 mL LB固体培养基混合均匀倒平板。粉葛不同组织的提取物用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，取10 μL，分3次滴加于滤纸片（直径为8.00 mm）上，将滤纸片置于混有菌液的培养基上，另设氨苄青霉素（100 mg/mL）作阳性对照、添加DMSO作阴性对照，37℃培养12 h，测抑菌圈直径。参照抗生素药敏标准：高敏（抑菌圈直径＞20 mm）、中敏（10 mm～20 mm）、轻敏或耐药（＜10 mm）。采用微量肉汤稀释法测定粉葛不同组织对供试菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，按美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M07-A10 的标准操作程序[18]进行操作，在12列8行规格的96孔板上依次添加以下内容：第2～12列的每孔加入含不同浓度粉葛组织活性成分的MH液体培养基100 μL，分别将培养好的菌液稀释1 000倍，每孔加入稀释菌液100 μL。第1列为空白培养基对照组，加入MH液体培养基200 μL。另设氨苄青霉素（100 μg/mL）96孔板作阳性对照组，37℃培养16 h后使用酶标仪HP4500检测OD600，根据CLSI M100-S25标准[18]，与第2列比较，抑制80%细菌生长的药物浓度为受试菌的MIC值。采用琼脂培养基平板法，取MIC以上未见细菌生长的孔内混合液与PDA固体培养基中均匀涂布，在37℃恒温培养箱中培养24 h后，观察有无细菌生长，以菌落数不超过5个的平板所对应孔中的最低浓度为该药物的最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration MBC）。

1.3 数据处理

所有试验数据运用Origin 9软件进行统计分析，数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制和线性关系考察

将 4 种不同浓度的混合标准液（5、8、10、12、15、18 μg/mL）分别进样5 μL，按1.2.3色谱条件进行分析。以峰面积为纵坐标（y），标准品浓度为横坐标（x），进行线性回归分析，求得线性回归方程和线性范围，结果见表1。

表1 线性回归方程及线性范围Table 1 Linear regression equation and linear range

由表1可知，葛根素、鹰嘴豆芽素、大豆苷和大豆苷元的线性方程分别为y葛根素=29.355 4x+50.621 7，R2=0.999 61；y鹰嘴豆芽素=62.340 5x+3.826 5，R2=0.999 34；y大豆苷=27.580 3x+19.720 2，R2=0.999 40；y大豆苷元=52.733 5x+0.740 6，R2=0.999 96。葛根素、鹰嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元均在5.00 μg/mL～18.00 μg/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系。

2.2 精密度与回收率试验

精密度结果见表2。

表2 标准品精密度试验结果（n=6）Table 2 Results of standard precision detection（n=6）

通过标准曲线得到葛根素、鹰嘴豆芽素、大豆苷、大豆苷元的含量，再计算出其相对标准偏差值（relative standrd deviation，RSD）分别为 1.601%、3.587%、1.792%、2.245%，RSD值均＜5%，可见此法的精密度良好，满足分析要求。

加样回收率结果见表3。

表3 回收率试验结果（n=3）Table 3 The results of recovery test（n=3）

4个标准品的平均回收率在97.37%～104.91%之间，葛根素的平均回收率为95.69%～97.96%，RSD为1.26%～2.14%；鹰嘴豆芽素的平均回收率为103.59～104.91%，RSD为0.84%～1.85%；大豆苷的平均回收率为103.28%～104.24%，RSD为0.38%～1.63%；大豆苷元的平均回收率为101.43%～103.12%，RSD为0.75%～2.31%，表明本方法准确可靠，可以满足测定的要求。

2.3 粉葛不同组织活性成分含量比较

粉葛不同组织活性成分含量见表4。

表4 粉葛不同组织活性成分含量（n=3）Table 4 Contents of active ingredients in different tissues of P.thomsonii（n=3）

由表4可知，粉葛不同组织中各活性成分含量有一定差异。大豆苷元、大豆苷2种黄酮活性成分在根中的含量最高，分别为（4.28±0.85）、（972.25±98.72）μg/g；葛根素在茎中的含量最高，为（7.37±1.14）mg/g；鹰嘴豆芽素在叶中的含量最高，为（33.48±4.01）μg/g。

2.4 抑菌活性测定

粉葛不同组织抑菌活性见表5。

表5 粉葛不同组织抑菌活性Table 5 Antibacterial activity of different tissues of P.thomsonii

如表5所示，滤纸片试验结果显示粉葛根部对金黄色葡萄球菌有中度敏感抑制作用（10 mm＜抑菌圈＜20 mm），抑菌圈直径为（10.50±0.39）mm；粉葛茎部对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、苏云金芽孢杆菌、多耐铜绿假单胞菌有中度敏感抑制作用，抑菌直径分别为（10.50±0.37）、（10.28±0.47）、（12.09±1.13）、（10.12±0.25）mm。粉葛叶对苏云金芽孢杆菌有中度敏感抑制作用，抑菌圈直径为（10.83±0.42）mm。采用微量肉汤稀释法测定粉葛不同组织对供试菌的MBC与MIC值，粉葛茎对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、苏云金芽孢杆菌和多耐铜绿假单胞菌的MIC值分别为0.55、2.21、1.10、17.67 mg/mL，MBC 值 分 别 为 4.42、8.84、4.42、17.67 mg/mL。粉葛叶对苏云金芽孢杆菌的MIC值为16.14 mg/mL，MBC值为64.57 mg/mL。

3 结论

本文通过HPLC检测发现粉葛不同组织活性成分含量不同，大豆苷元、大豆苷在根含量最高；鹰嘴豆芽素在叶中含量最高；葛根素在茎中含量最高。粉葛根部对金黄色葡萄球菌有中度敏感抑菌效果，粉葛茎部对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、苏云金芽孢杆菌、多耐铜绿假单胞菌有中度敏感抑菌效果，粉葛叶对苏云金芽孢杆菌有中度敏感抑菌效果。粉葛不同组织中根与茎的活性成分含量高于叶，同时粉葛茎部的抑菌活性优于根部与叶。本研究为后期粉葛的开发利用提供了参考，对促进粉葛产业发展具有重要意义。