冠心病患者CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量与冠状动脉狭窄程度的相关性分析及预测价值*

郭 娜,赵 凯,金 珊,王成燕,沈西华,蔡文平,段军仓,刘克坚,庞丽娟△

1石河子大学医学院第一附属医院病理科/国家卫生健康委中亚高发病防治重点实验室/石河子 大学医学院病理学系/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室,石河子 832002

2浙江省金华市中心医院心内科,金华 321000

3石河子大学医学院第一附属医院心内科,石河子 832002

冠状动脉粥样硬化性心脏病又名冠心病(coronary heart disease,CHD),是全球人类死亡的最主要原因[1]。介入手术治疗是缓解相关临床症状最有效的血运重建手段,但仍有10%～20%的患者出现术后再狭窄[2]。目前,冠状动脉造影是冠心病诊断的金标准。但其操作复杂且价格昂贵,不适用于开展早期大规模筛查诊断工作。

冠心病发生的基本病理基础为冠状动脉粥样硬化形成及斑块的沉积,炎症反应已被证实参与此过程[3]。CD8+T细胞是动脉粥样硬化炎症反应过程的关键参与者,对冠心病发生发展起调控作用[4]。PD-1/PD-L1负性共刺激通路与TGF-β1信号通路在机体免疫炎症反应中具有协同作用,均可抑制T细胞活性,从而减弱T细胞介导的免疫抑制并参与免疫介导的组织损伤过程[5]。文献报道PD-1/PDL1通路表达水平的变化可通过改变动脉粥样硬化炎症程度和粥样斑块的状态参与冠心病的发病过程[6]。TGF-β1信号通路也参与了冠心病启动及进展的各个阶段,在机体炎症反应、高密度脂蛋白含量、斑块稳定程度、血管平滑肌细胞的增殖迁移及血小板活性调控方面发挥重要作用[7]。有文献证实,在创面炎症调控紊乱所致的难愈创面或病理性瘢痕中TGF-β1可上调PD-L1表达,从而促进创面愈合[8];同时在TGF-β1存在时,PD-L1可诱导大量的幼稚T细胞发生转化[9]。MMP-14不仅可调节TGF-β1的生物活性,而且可降解细胞外基质成分,水解潜伏的TGF-β1结合蛋白,从而在细胞外基质中释放潜在TGF-β1,进而调节粥样斑块的发生和血管损伤修复过程[10]。

本研究借助生物信息学方法对CD8、PD-1、PDL1、TGF-β1、MMP-14进行GO和KEGG通路富集分析,利用STRING在线网络数据库构建PPI网络分析CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14之间的相互作用。同时采用酶联免疫吸附法(ELISA)验证冠心病不同Gensini评分患者血浆CD8、PD-1、PDL1、TGF-β1、MMP-14含量差异,并探究其与冠状动脉狭窄程度的相关性,探讨血浆CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14分子含量变化对冠心病发病的预测价值。研究流程见图1。

图1 研究设计流程图Fig.1 Flowchart of study design

1 资料与方法

1.1 GO和KEGG通路富集分析

使用R语言中的“Cluster Profiler”对CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14进 行GO和KEGG富集通路分析。

1.2 PPI网络构建

利用STRING在线网络数据库构建PPI网络图分析CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14之间的相互作用。

1.3 临床资料收集

收集2019年6月至2020年6月就诊于石河子大学医学院第一附属医院的冠心病患者39例,其中男性25例,女性14例,平均年龄(60.00±10.91)岁。纳入标准:①行冠状动脉造影检查明确诊断为冠心病;②行血液生化指标及全血细胞计数检查;③基本临床资料完整。排除标准:①先天性心脏病、心脏瓣膜病等其他器质性心脏病;②合并心肝肾等重要器官功能不全;③合并恶性肿瘤;④合并糖尿病、甲状腺功能亢进等消耗性疾病;⑤合并乙肝、艾滋病等传染性疾病;⑥合并严重感染。

1.4 分组方法

根据Gensini评分系统(表1)对纳入患者的冠状动脉狭窄程度进行评分,每处冠状动脉病变的积分为该处狭窄程度评分乘以病变部位评分,每位患者的总积分为所有病变积分的总和。根据病变总积分将所入选39例患者冠状动脉狭窄程度分为轻、中、重3组,积分0～6为轻组,积分6～10为中组,积分11～172为重组。

表1 Gensini评分系统Table 1 Gensini scoring system

1.5 血清学指标检测

收集纳入研究的冠心病患者股动脉血,采用高速冷冻离心机(赛默飞,美国)3000×g离心15 min获取血浆。ELISA(Elabscience,武汉,中国)测定血浆中CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14的含量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,3组间数据分析采用单因素方差分析,组间数据比较采用t检验,假定方差齐使用LSD法,未假定方差齐性使用Tamhane法。采用相关性分析探究CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量分别与冠心病Gensini评分间的关系,以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GO和KEGG富集通路分析

GO和KEGG通路富集分析显示所选基因CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14与冠心病发生发展及相关炎症过程相关。GO主要富集于淋巴细胞活化正向调节、白细胞激活正向调控、细胞激活正向调控、质膜外侧面、高尔基腔、MHCⅠ类蛋白结合、转化生长因子受体结合,见图2和表2。KEGG主要富集于细胞粘附分子、PD-L1表达和PD-1检查点通路在癌症中的作用、T细胞受体信号通路、原发性免疫缺陷,见表3和图3。

图3 KEGG通路富集分析图Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis

表2 GO富集分析Table 2 GO enrichment analysis

表3 KEGG通路富集分析Table 3 KEGG pathway enrichment analysis

图2 GO富集分析图Fig.2 GO enrichment analysis diagram

2.2 PPI网络构建

CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14间PPI网络显示各分子间存在一定相互作用关系,见图4。

图4 PPI网络图Fig.4 PPI network diagram

2.3 纳入病例的分组及一般临床资料比较

根据纳入标准及排除标准,本研究共收集39例冠心病病例,依照Gensini评分系统分为轻、中、重3组,分组情况见表4。轻组和重组的Gensini评分与性别、吸烟情况等方面无明显相关(均P＞0.05),中组Gensini评分与患者性别、吸烟情况方面存在相关性(P＜0.05),见表5、6。轻、中、重3组在收缩压、舒张压、血糖、总胆固醇(TC),三酰甘油(TG),高密度脂蛋白(H-DLC),低密度脂蛋白(L-DLC)方面的差异均无统计学意义(均P＞0.05),而在年龄、血小板计数、中性粒细胞百分比等方面的差异具有统计学意义(均P＜0.05),见表7。

表4 三组病例Gensini评分结果Table 4 Gensini scores in the three groups of patients

表5 三组病例Gensini评分与性别情况Table 5 Gensini scores and gender in the three groups of patients

表6 三组病例Gensini评分与吸烟情况Table 6 Gensini scores and smoking history in the three groups of patients

表7 三组病例其他一般临床资料比较(±s)Table 7 Comparison of other general clinical data of the three groups(±s)

表7 三组病例其他一般临床资料比较(±s)Table 7 Comparison of other general clinical data of the three groups(±s)

TC:总胆固醇,TG:三酰甘油,H-DLC:高密度脂蛋白,L-DLC:低密度脂蛋白;与轻组比较,*P＜0.05

组别 n 年龄(岁) 收缩压(mm Hg)舒张压(mm Hg)血糖(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)H-DLC(mmol/L)L-DLC(mmol/L)血小板(109/L)中性粒细胞百分比(%)轻组 16 54.19±8.93 134.88±19.35 82.75±14.67 5.25±1.85 4.42±1.10 2.21±1.91 1.31±0.24 2.18±0.78 255.56±56.40 57.64±7.09中组 8 63.13±9.16*133.25±19.42 77.88±14.21 5.26±1.53 3.60±0.86 1.22±0.37 1.13±0.27 1.84±0.67 204.75±59.61*59.45±9.72重组 15 64.60±11.36*133.87±21.94 84.93±15.81 6.73±3.02 3.91±1.12 1.46±0.86 1.37±0.68 1.81±0.62 201.73±55.50*65.26±11.58*

2.4 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量比较

轻、中、重3组CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1含量的差异均存在统计学意义(均P＜0.05),其中CD8、PD-1、TGF-β1均表现为仅在重组与轻组之间存在显著差异(均P＜0.05),PD-L1含量在中组与轻组、重组与中组之间均存在显著差异(均P＜0.05),而MMP-14血浆含量在三组间差异无统计学意义(P＞0.05),见表8和图5。

图5 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量Fig.5 The levels of CD8,PD-1,PD-L1,TGF-β1,MMP-14 in plasma

表8 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量比较(±s,pg/m L)Table 8 Comparison of CD8,PD-1,PD-L1,TGF-β1,and MMP-14 in plasma(±s,pg/m L)

表8 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量比较(±s,pg/m L)Table 8 Comparison of CD8,PD-1,PD-L1,TGF-β1,and MMP-14 in plasma(±s,pg/m L)

与轻组比较,*P＜0.05;与中组比较;#P＜0.05

分组 样本数 CD8 PD-1 PD-L1 TGF-β1 MMP-14轻组 16 0.12±0.05 0.09±0.02 0.75±0.12 1.17±0.41 1.69±0.34中组 8 0.12±0.03 0.12±0.06 0.83±0.36* 1.07±0.33 1.69±0.54重组 15 0.09±0.03* 0.15±0.10* 1.19±0.44*# 0.89±0.23* 1.91±0.25

2.5 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量与Gensini评分的相关性分析

PD-L1含量与Gensini评分呈线性关系,为显著正相关(P＜0.05)。CD8、PD-1、TGF-β1、MMP-14与Gensini评分的线性关系均不显著(P＞0.05)。但从趋势上来看,CD8、TGF-β1与Gensini评分存在负相关趋势,PD-1、MMP-14与Gensini评分存在正相关趋势,见表9。

表9 Gensini评分与CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量的相关性分析Table 9 Correlation analysis between Gensini scores and CD8,PD-1,PD-L1,TGF-β1,MMP-14 in plasma

3 讨论

冠心病是全球最新十大死亡疾病排名中死亡率最高者,可因冠状动脉粥样斑块阻塞而致心脏发生缺血缺氧乃至功能障碍[11]。近年来,由于城镇化进程的推进及人民生活水平的不断提高,我国冠心病发生呈现年轻化趋势且病死率逐年上升。因此,对冠心病的发生进行早期筛查及预测显得极为重要。

冠状动脉粥样硬化是冠心病发生的病理基础,免疫炎症及炎症因子在这一过程中发挥至关重要的作用[6]。文献报道,被激活的T细胞存在于冠状动脉粥样硬化的各个时期,而且在冠脉早期脂质条纹中CD8+T细胞占大多数[12]。在大鼠粥样硬化模型心肌坏死组织中聚集有CD8+T细胞,其可识别、杀死正常心肌细胞,并分泌干扰素-γ(IFN-γ)和趋化因子,加重急性炎症,扩大梗死面积[13]。孔祥权等[14]指出在冠心病患者斑块进展和破裂处可检测到激活的CD8+T细胞比例明显升高,提示我们CD8+T细胞水平变化可能与不稳定冠状动脉粥样斑块形成有关。在冠心病患者外周血中,CD8+T细胞比例降低,并且病情越重数值变化则越大,由此得出外周血CD8+T细胞比例变化可作为病情评估的指标[15]。而CD8+T细胞及所介导的炎症反应会受到PD-1/PD-L1途径及炎症因子TGF-β1所传递的负性信号的共同调控。

有研究发现在PD-1/PD-L1基因敲除小鼠中,动脉血管粥样硬化病变区域显著增大,证实PD-1/PD-L1途径可通过限制T细胞活化从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成[16]。PD-1/PD-L1信号的下调可减少负向刺激信号的传递,促进冠心病粥样斑块形成。同时PD-1与PD-L1的结合也可抑制T细胞相关炎症因子白细胞介素-2(IL-2)、IFN-γ等的分泌,而这些炎症因子可促进粥样斑块的形成,最终抑制冠心病的发生发展[17]。TGF-β1不仅可以通过上调抗原提呈细胞上PD-L1的表达而间接参与冠心病炎症反应途径,而且可通过抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1、IFN-2等炎症因子的表达,使 参与斑块形成的中性粒细胞发生凋亡,从而稳定斑块[18]。也有学者提出TGF-β1可促使血管平滑肌细胞发生增殖,从而增强内膜增生程度来加快冠心病的发展[19]。虽然TGF-β1对冠心病粥样斑块形成发挥促进还是抑制作用仍备受争议,但是已有学者证明粥样斑块中TGF-β1的含量比正常组织高出3倍,并提出TGF-β1与冠心病严重程度具有相关性[18]。而TGF-β1的表达水平与MMP-14密切相关,MMP-14可促进潜在TGF-β1释放,而释放出来的TGF-β1又可诱导MMP-14的表达,另外MMP-14也能够通过TGF-β1信号通路促进冠脉血管的纤维化及胶原重构过程。因此MMP-14可通过TGFβ1与PD-1/PD-L1途径间接参与冠心病粥样硬化及相关炎症反应的发展过程。

本研究以冠心病粥样硬化形成过程中的免疫炎症反应为切入点,在文献查阅基础上,通过GO和KEGG通路富集分析及PPI蛋白质互作网图,确定了CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14分子间可发生相互作用,并参与冠心病及相关炎症反应途径。同时收集39例冠心病临床样本及其病例资料,检测血浆CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14含量,验证各分子含量与冠心病不同Gensini评分患者的相关性。结果显示CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血浆含量的确与冠心病发病相关,PD-L1含量与Gensini评分呈显著正相关,CD8、PD-1、TGF-β1、MMP-14与Gensini评分的线性相关关系均不显著,但从趋势上来看,CD8、TGF-β1与Gensini评分存在负相关趋势,PD-1、MMP-14与Gensini评分存在正相关趋势。

综上所述,CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14可参与冠心病的发生发展过程,并且各分子血浆含量与冠状动脉狭窄程度存在相关趋势,是潜在的冠状动脉狭窄程度的预测指标,这为冠心病的早期筛查与预测提供理论依据。