基于线粒体pcox1分析蛇蛔虫种系发育关系*

李文超 龚腾芳 李 芬 刘 伟

(湖南农业大学动物医学院，长沙 410128)

蛇蛔虫是蛇常见的一种寄生线虫，主要寄生在蛇的肠道和胃，引起慢性消耗性疾病(周成艳等，2019)。蛇蛔虫在世界范围内普遍存在，对蛇的危害较大，能够引起蛇的免疫力下降、食欲不振，消瘦(王挺等，2013；张韬等，2015)，寄生在消化道会引起严重的机械性损伤(黄潇航等，2020)，多量寄生时甚至会引起蛇的死亡(黄潇航等，2021)。近些年，由于蛇类药用价值极大，市场需求量增大，蛇蛔虫逐渐引起人们的注意。因此正确鉴定蛇蛔虫不仅具有重要的学术价值，对蛇蛔虫的防控也具有重要意义。

据现有资料报道，可感染蛇的蛔科线虫分为4个属(多宫属Polydelphis、羽蛔属Orneoascaris、六宫属Hexametra、蛇蛔属Ophidascaris)，其中以蛇蛔属的丝状蛇蛔线虫Ophidascarisfilaria最为普遍(周成艳等，2019)。目前对于蛇蛔虫的鉴定主要依赖于地理分布和交合刺与输精管的长度比较，然而，这种长度在一些物种还没有报道，例如莫雷利亚蛇蛔线虫、无尖蛇蛔线虫和丝状蛇蛔线虫(Zhaoetal.，2021)。线粒体DNA具有特殊的双链结构、遗传稳定性高、母系遗传等优势，在研究物种的遗传结构和系统发育关系适用于分子标记(郝桂英等，2017；龚腾芳等，2021)。据文献报道利用cox1基因进行进化分析，认为蛇蛔虫与盲囊属蛔虫Contracaecum的亲缘关系较近(吴有陵等，2014)；基于cox1构建的系统发育树发现蛇蛔虫与禽蛔虫Ascaridiagalli聚在一起(陈文承等，2011)；选用核糖体基因ITS及5.8 S基因进行序列分析得到蛇蛔虫与人蛔虫相似度较高(郑姣妹等，2012)，与人蛔虫处于同一进化树分支。蛇蛔虫种类繁多，但目前国内外关于蛇蛔虫的分子生物学分类鉴定的研究甚少，蛇蛔虫目前还缺乏系统性的研究。

本研究对采自湖南省3个地区的11 株蛇蛔虫分离株pcox1基因进行PCR扩增和序列分析，对分离株的种类进行鉴定。同时基于pcox1基因，构建蛇蛔虫与其他蛔虫的种系发育关系，从而明确蛇蛔虫线粒体cox1基因是否成为理想的种间遗传标记，为今后蛇蛔虫的分子遗传和种群遗传结构研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫体样本

本次研究所获得的蛔虫样品来自3个地区的乌梢蛇的肝脏部位(长沙1条、常德1条、衡阳1条)，共获得湖南长沙4条蛔虫分离株(CS1-4)、常德4条蛔虫分离株(CD5-8)、衡阳3条蛔虫分离株(HY9-11)。

1.2 主要试剂

TaqDNA聚合酶及相关试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，蛋白酶 K购自Merck公司，DNA提取试剂盒等耗材购自Promega公司。

1.3 基因组DNA提取

用超纯水反复冲洗虫体4～5次，将每条虫体单独放于无菌1.5 mL Eppendorf管中，用无菌的眼科剪将虫体组织剪碎，加入200 μL的GT buffer充分研磨，再加入20 μL蛋白酶K混匀，放于56 ℃的水浴箱中消化4 h(每30 min混匀1次)。消化完成的虫体悬液使用组织DNA试剂盒提取总基因组DNA。

1.4 PCR扩增

按照文献(Gasseretal.,1998) 方法合成1对引物，即JB3:5′-T T T T T T G G G C A T C C T G A G G T T T A T-3′，JB4.5:5′-T A A A G A A G A A C A T A A T G A A A A T G-3′。引物由北京擎科生物有限公司合成。PCR扩增体系为25 μL，Premix TaqTM 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL、上下游引物(100 pmol/μL)各0.5 μL、模版DNA 1 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性、55 ℃退火、72 ℃延伸均为30 s，共循环38次;最后72 ℃延伸5 min。

1.5 pcox1基因测序及分析

PCR阳性产物由北京擎科有限公司双向测序。用DNAMAN 7.0对获得的pcox1序列进行对比、剔除和对齐，并与GenBank收录的其他蛇蛔属线虫cox1基因进行对比。用 DNAStar 软件中的MegAlign程序进行基因同源性分析；利用DnaSP 5.0软件计算单倍型数、核苷酸多样性、单倍型多样性和平均核苷酸差异；以鸡蛔虫Ascaridiagalli(KT613902)为外群，选用Kimura-2-parameter模型，用Mega 7.0 程序中的邻接法(Neighbor-joining method,NJ)绘制种系发育树，自举检验1 000次。

2 结果

2.1 剖检结果

将3条死亡乌梢蛇进行解剖，结果显示：心脏、左右双肺、胃肠、肾脏等处均无明显病变，肝脏表面有异常凸起，大小不一，囊膜灰白色(图1-A)，打开每个凸起里面都有一条长条状线虫(图1-B、C)。完整虫体长度为4～6 cm。将虫体进行镜检，雌虫：尾端呈现钝圆椎形(图2)，头端细长(图3)，阴门位于虫体中央偏后(图2)。此次实验未收集到雄虫。

图1 蛇肝脏临床解剖图Fig.1 Clinical anatomy of snake liverA．肝脏表面4个未破损包囊；B.打开的包囊；C.肝脏表面蛔虫A.Four undamaged cysts on the liver surface；B.Open cysts;C.Liver surface roundworm

图2 雌虫尾端形态特征Fig.2 Morphological characteristics of female caudal end

图3 雌虫前端形态特征Fig.3 Morphological characteristics of female front end

2.2 PCR扩增分析结果

11株蛇蛔虫分离株扩增的片段大小均为400 bp左右，未见特异性条带，空白对照为阴性(图4)。

图4 蛇蛔虫线粒体pcox1扩增产物的凝胶电泳图Fig.4 Analysis of PCR products of mt DNA pcox1 of Ophidascaris sp.isolates by agerose gel electrophoresisM:DL2000 DNA 标志物;N:阴性对照;1-11:CS1-4、CD5-8、HY9-11M:DL2000 DNA marker;N:Negative control;1-11:PCR products from CS1-4,CD5-8,HY9-11,respectively

2.3 pcox1基因的多样性

经过对比校正后，11条蛇蛔虫分离株扩增出长度为398 bp的pcox1序列，A+T碱基含量为64.00%～64.30%，C+G碱基含量为35.70%～36.00%。测序获得的11条序列已经上传至GenBank数据库，登录号为MZ960363～MZ960373。11株蛇蛔虫pcox1基因碱基序列相似度很高，为97.30%～100.00%，碱基变异率为0.00%～2.70%，主要为碱基转换或颠换，未发现碱基的缺失或插入(图5)。本研究所获pcox1基因与GenBank收录的丝状蛇蛔线虫相似度很高，为97.00%～99.30%，与异尖科(Anisakidae)其他线虫对应的pcox1基因序列同源性为77.60%～87.50%。利用DnaSP 5.0软件对11株蛇蛔虫pcox1基因进行单倍型分析，共检测到9种单倍型，碱基序列总单倍多样性和核苷酸多样性分别为0.924 ± 0.003和0.008 ± 0.009，平均核苷酸差异为3.255，多态性位点10个。

2.4 种系发育分析

基于pcox1基因构建系统发育树，结果见图6。湖南省3个地区11株蛇蛔虫与GenBank收录的中国丝状蛇蛔线虫分离株和Ophidascarissp.聚类形成一分支，且3个地区的蛇蛔虫分离株随机分布；丝状蛇蛔线虫与盲囊属蛔虫亲缘性最近，与其他异尖科线虫所属的分支相隔较远，可与其他异尖科线虫相鉴别。

3 讨论

蛇蛔虫是对蛇类危害严重的寄生虫之一，感染蛇后可引起严重的临床症状，甚至死亡(Zhouetal.，2021)。当感染期蛔虫卵被宿主吞入，会在小肠内孵化成幼虫。幼虫通过分泌透明质酸酶和蛋白酶，侵入到宿主的小肠粘膜和粘膜下层，钻入肠壁小静脉或淋巴管，经静脉进入肝脏。所以此次实验在肝脏表面发现的蛔虫，可能系蛔虫幼虫移行。蛇蛔虫的有效鉴定是对蛇蛔虫病进行预防的前提，但传统的形态学难以对形态相似的虫株进行准确的鉴定。随着分子生物学的飞速发展，采用 PCR方法对寄生虫线粒体基因进行扩增和分析，为寄生虫分类与鉴定提供了有力的工具(王旭等，2020)。

大量研究表明，cox1可作为线虫遗传分子标记(郝桂英等，2017；程文杰等，2020;王旭等，2020)。本文通过对湖南省部分地区(长沙、常德和衡阳)蛇蛔虫线粒体pcox1基因序列分析蛇蛔虫遗传进化情况，结果发现，扩增得到的11株蛇蛔虫pcox1基因序列大小为398 bp，基因种内遗传变异率97.30%～100.00%，其种内遗传变异为0.00%～2.70%。本研究获得蛇蛔虫pcox1序列与GenBank收录的丝状蛇蛔线虫同源性为97.00%～99.30%，与其他异尖科线虫差异较大。结果表明本实验11株湖南蛇蛔虫分离株样品均为丝状蛇蛔线虫，且丝状蛇蛔线虫pcox1基因序列种内差异较小，种间差异大。衡量一个种群线粒体遗传变异的两个重要指标为单倍型多样性和核苷酸多样性。单倍型多样性可以随着一个碱基改变在短时间内快速上升，但核酸多样性影响却很小，因此核苷酸多样性更适用于衡量物种的遗传多样性(郝桂英等，2015)。对于大多数生物来说，核苷酸多样性大于0.001可认为有较大变异。本研究中，11株丝状蛇蛔线虫分离株pcox1基因序列单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.924 ± 0.003和0.008 ± 0.009，结果表明丝状蛇蛔线虫pcox1基因遗传变异程度低。

基于11条丝状蛇蛔线虫pcox1基因序列构建的种系发育树显示，所有的湖南分离株与GenBank收录的丝状蛇蛔线虫聚合为同一分支，不同地区源(长沙、常德、衡阳)分离株样品在分支上为随机分布，暗示湖南丝状蛇蛔线虫的进化速率不受地区差异的影响。丝状蛇蛔线虫分支与其他异尖科蛔虫分支相隔较远，可以得到很好的鉴定。丝状蛇蛔线虫所处分支与盲囊属蛔虫的亲缘关系最近，这与吴有陵等(2014)结果相同。陈文承等(2011)通过pcox1基因序列认为蛇蛔虫与鸡蛔虫亲缘关系较近，郑娇妹等(2012)分析得到蛇蛔虫与人蛔虫相似度较高，本研究结果显示丝状蛇蛔线虫分支与人蛔虫、鸡蛔虫分支相隔较远，揭示本研究分离株与其他两人分离的蛔虫样品互为不同物种，同时表明湖南地区蛇蛔虫病感染复杂多样和种类鉴定空白，准确的鉴定对蛇蛔虫的防治具有重要的意义。

综上所述，本研究利用线粒体pcox1基因对湖南3个地区蛇蛔虫分离株进行种群鉴定和遗传结构研究。结果表明11株蛇蛔虫样品均为丝状蛇蛔线虫，基于pcox1基因分析揭示丝状蛇蛔线虫种内相对保守，种间差异较大，能够作为丝状蛇蛔线虫的遗传分子标记。本研究为蛇蛔虫的分类鉴定以及流行病学调查和种群遗传结构奠定了基础。