胱胺衍生物的合成及抗非小细胞肺癌活性研究

许 萍，丁 锐，江 娟，邹远军，郭牡丹，刘晶晶，郑一敏*

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400050; 2.成都与康科技有限公司，四川 成都 610000)

国际癌症研究机构数据显示，截至2018年，肺癌是最常见的癌症(占总病例的11.6%)，也是癌症死亡的主要原因之一(占总癌症死亡的18.4%)[1]。而肺癌中最常见的病理学类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。NSCLC占全部肺癌的85%，从病理类型可分为大细胞癌、腺癌、鳞癌等[2-4]。通过干扰多胺的代谢来耗竭细胞内多胺(polyamines)，以及抑制多胺促细胞的生长功能，逐渐成为当今抗肿瘤治疗和药物设计的新策略[5-6]。

多胺如腐胺、尸胺、胱胺、亚精胺及精胺等，是一类生物内源性分子，在神经保护及抗肿瘤药物设计中颇受关注[7-8]。而多胺类似物(polyamine analogue)是一类潜在的新型抗肿瘤药物。按化学结构特征可以把多胺类似物分为对称烷基化、不对称修饰、长链以及构象限制多胺类似物等[9]。研究表明，胱胺(cystamine)与载药胶束交联具有强大的抗肿瘤活性，导致肿瘤细胞的凋亡增加，肿瘤体积显著减小[10-11]。

利用药物拼合原理，以多胺中的胱胺为母核结构设计、合成了7种对称的多胺类似物，采用CCK-8法对其抗人肺鳞癌细胞NCI-H520及人支气管上皮细胞16HBE的增殖活性进行测试，以期获得新型、高效的抗NSCLC药物。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RCH-1000型带加热板磁力搅拌器(东京理化器械株式会社)；VOS-310C型真空定温干燥器(东京理化器械株式会社)；DL-400型循环冷却器(郑州长城科工贸有限公司)；N-1300型旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)；Varian Mercury-400 型核磁共振仪 (美国Varian公司)；Finnigan-LCQDECA (ESI-MS)(美国热电公司)。

合成实验所用试剂均为市售化学纯或分析纯；薄层和硅胶(200～300目，青岛海洋硅胶厂)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)；DMEM细胞培养基(美国Hyclone公司)；人肺鳞癌细胞株NCI-H520(ATCC细胞库)；人支气管上皮细胞株16HBE(ATCC细胞库)。

1.2 胱胺衍生物的合成

称取胱胺二盐酸盐(1)(100 mmol，22.4 g)至1 000 mL三颈圆底烧瓶中，加入4 mol/L的NaOH溶液700 mL于室温搅拌3～6 h，用正丁醇萃取(500 mL×3)，真空旋除溶剂，得淡黄色油状物即为胱胺(2)。

参考文献方法[12]，在Ar气保护和无水条件下，将胱胺(3 mmol，456 mg)和a～g(6.6 mmol)加入到100 mL双颈圆底烧瓶中，缓慢加入无水三乙胺(3 mmol，0.42 mL)，并加入30～50 mL无水乙醇回流搅拌6～8 h。TLC板检测，待反应完全后，置冷，真空旋除溶剂，得到中间产物3a～3g，加入无水甲醇(6～10 mL)并转移至50 mL双颈圆底烧瓶中进入下一步。

在Ar气保护和无水条件下，向装有中间体3a～3g的烧瓶中缓慢滴加NaBH4(7.5 mmol，0.285 g)的甲醇(25 mL)溶液，待滴加完毕，混合物在室温下搅拌过夜。TLC检测，待反应完全后，真空旋除溶剂，加入50 mL冰水，用乙酸乙酯(50 mL×3)萃取，合并有机相，用Na2SO4干燥，过滤，真空蒸除溶剂得残留物，残留物用硅胶柱层析分离，真空干燥得目标化合物4a～4g(合成路线见图1)。

1.3 体外抗NSCLC活性测试

采用CCK-8法测定目标化合物4a～4g对NSCLC细胞NCI-H520和人支气管上皮样细胞16HBE的增殖抑制活性，吉非替尼(gefitinib)为阳性对照。收集对数生长期的NCI-H520细胞和16HBE细胞，分别按每孔2 500个NCI-H520细胞和每孔5 000个16HBE细胞的密度加入96孔板中，实验分组包括：加药组(90 μL细胞悬液+10 μL终浓度为120、100、50、25、10、1、0.1 μmol/L的药物)、阴性对照组(90 μL细胞悬液+10 μL 1%DMSO)和空白对照组(100 μL不含细胞的完全培养基)，每个浓度设3个复孔。加药继续培养24小时后取出，之后每孔加入10 μL CCK-8，NCI-H520细胞放入培养箱培养1 h、16HBE细胞放入培养箱培养2 h后取出，在450 nm波长下测定其吸光度值，计算抑制率。重复三次后计算各化合物的IC50值。

2 结果与分析

2.1 目标化合物的结构确证

化合物4a：N,N′-(二硫基-2,1-二乙基)双(2-吡咯甲胺)，淡黄色粉末(产率68.4%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：6.61 (dd,J= 4Hz, 2H, =CH-)，5.90 (m, 2H, =CH-)，5.86 (s, 2H, =CH-)，3.63 (s, 4H, CH2)，2.75 (s, 8H, CH2)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：130.99, 117.15, 107.42, 106.24, 49.08, 45.95, 38.79；ESI-MS(m/z) [M+H]+= 311.13。

化合物4b：N,N′-(二硫基-2,1-二乙基)双(2-呋喃甲胺)，淡黄色粉末(产率72.2%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：7.55 (s, 2H, =CH-)，6.28 (m, 2H, =CH-)，6.23 (d,J=2.8Hz, 2H, =CH-)，3.68 (s, 4H, CH2)，2.77(s, 8H, CH2);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ：154.68, 142.27, 110.18, 107.18, 47.89, 45.49, 38.59；ESI-MS(m/z) [M+H]+= 313.10。

图1 胱胺衍生物的合成路线Fig.1 Synthetic routes of cystamine derivatives

化合物4c：N,N′-(二硫基-2,1-二乙基)双(2-噻吩甲胺)，淡橘色粉末(产率81.4%)。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ：7.32 (dd,J= 1.2 Hz, 5.4Hz, 2H, =CH-)，6.97 (m, 4H, =CH-)，4.89 (s, 2H, CH2)，3.99(s , 4H, CH2)，2.91 (t,J=7.2 Hz, 4H, CH2)，2.83 (t,J=6.6Hz, 4H, CH2)；13C NMR (150 MHz, MeOH-d4)δ：141.95, 126.49, 125.84, 124.59, 48.12, 47.98, 47.84, 47.69, 47.55, 47.41, 47.27, 46.81, 46.68, 46.17, 37.25；ESI-MS(m/z) [M+H]+= 343.50。

化合物4d：N,N′-(二硫基-2,1-二乙基)双(2-吡啶甲胺)，淡黄色粉末(产率82.2%)。1H NMR (600 MHz, MeOH-d4)δ：8.53 (m, 1H, =CH-)，7.81 (tdd,J=7.7, 6.1, 1.8 Hz, 1H, =CH-)，7.48(dd,J=7.7, 5.3 Hz, 1H , =CH-)，7.31 (tdd,J=7.7, 6.1, 1.8 Hz, 1H, =CH-)，3.92 (d,J=6.0 Hz, 2H, CH2)，2.95 (dd,J=9.4, 6.4 Hz, 2H, CH2)，2.88 (dd,J=15.5, 6.3 Hz, 2H, CH2)；13C NMR (150 MHz，MeOH-d4)δ：158.95, 158.94, 148.63, 137.26, 137.24, 122.72, 122.69, 122.43, 122.41, 53.67, 48.63, 47.28, 39.85, 39.76, 37.67, 37.62；ESI-MS(m/z) [M+H]+= 335.12。

化合物4e：N,N′-(二硫基-2,1-二乙基)双(4-羟基苯甲胺)，白色粉末(产率79.7%)。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ：7.09 (d,J=12 Hz, 4H, ArH)，6.69 (d, J=12 Hz, 4H, ArH)，3.57 (s, 4H, CH2)，2.76(s, 8H, CH2);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.51, 131.23, 129.55, 115.32, 52.56, 49.06, 38.82；ESI-MS(m/z) [M+H]+= 365.10。

化合物4f：N,N′-(二硫基-2,1-二乙基)双(2-氟苯甲胺)，白色粉末(产率85.8%)。1H NMR(600 MHz, MeOH-d4)δ：7.38 (td,J= 1.8, 7.2 Hz, 2H, ArH)，7.21(m, 2H, ArH)，7.14 (td,J=0.6, 8.4 Hz, 2H, ArH)，7.01 (m, 2H, ArH)，4.83(s, 2H, CH2)，3.83 (s, 4H, CH2)，2.88 (t,J=7.2 Hz, 4H, CH2),2.80 (t,J=6.6 Hz, 4H, CH2)；13C NMR (150 MHz, MeOH-d4)δ:162.04, 160.42, 130.55, 130.52, 129.02, 128.96, 126.22, 126.12, 124.12, 124.09, 115.01, 114.87, 48.19, 48.05, 47.90, 47.76, 47.62, 47.48, 47.34, 46.97, 45.90, 45.88, 37.43；ESI-MS(m/z) [M+H]+= 367.50。

化合物4g：N,N′-(二硫基-2,1-二乙基)双(2-溴苯甲胺)，白色粉末(产率83.3%)。1H NMR (600 MHz，MeOH-d4)δ：7.37(m, 4H, ArH)，7.24 (d,J=8.5Hz, 4H, ArH)，3.27(s, 4H, CH2)，2.86 (dd,J=3.7, 10.2Hz, 4H, CH2),2.80 (t,J=6.3 Hz, 4H, CH2);13C NMR (150 MHz, MeOH-d4)δ：138.58, 131.27, 130.11, 120.65, 52.01, 47.03, 37.49；ESI-MS(m/z) [M+H]+= 389.12。

上述目标化合物的核磁共振和质谱数据，可以使目标化合物的结构得到确证，并且与预期结果相符。

2.2 目标化合物的细胞活性

化合物4a～4g的细胞活性见表1。

表1 化合物4a～4g对NCI-H520和16HBE细胞的IC50值(n=3)

由表1可知目标化合物4a～4g对NCI-H520和16HBE细胞增殖抑制活性均弱于阳性对照吉非替尼，而化合物4f和4g对NCI-H520细胞的增殖抑制活性均强于阳性对照吉非替尼，且对正常细胞16HBE的抑制作用与阳性对照相当。由目标化合物结构与活性关系可以看出：苯环取代的化合物活性优于杂环取代的化合物；而芳环上引入卤原子活性要优于羟基化合物；对于4f和4g化合物，引入苯环上溴原子化合物活性要优于氟原子，且对正常细胞的毒性要更微弱。

3 结论

通过药物拼合原理，以多胺中的胱胺为母核结构设计、合成了7种对称的胱胺衍生物4a～4g，并经ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR谱进行了结构确证。采用CCK-8法对其体外抗NSCLC活性进行初步研究，化合物4a～4g对NCI-H520细胞增殖具有不同程度的抑制活性，其中化合物4f和4g的抑制活性强于阳性对照吉非替尼，且化合物4g活性最强，而化合物4f对16HBE细胞的抑制作用要弱于阳性对照吉非替尼。据文献报道[13-15]，胱胺衍生物的合成研究逐渐成为热点，其中胱胺联苯与PEG(聚乙二醇)偶联的化合物可以增强小分子抗肿瘤的活性，开发的单克隆抗体用来阻断与程序性细胞死亡1(PD-1)及其配体PD-L1相关的免疫检查点途径。胱胺衍生物的开发有了较大的进展，鉴于同为胱胺衍生物的化合物4f和4g对NSCLC活性有较强的抑制，故可作为先导化合物进行深入研究。