网状Meta分析不同硒源对奶牛乳硒、血硒、生产性能及相关抗氧化指标的影响
2022-02-26张伯池杨春雷杜丽英董小雨宋献艺
■赵 睿 张 凯 张伯池 杨春雷 杜丽英 董小雨 宋献艺
（山西农业大学动物科学学院，山西 太原 030031）
硒是人体的必需微量元素之一，主要以蛋氨酸硒储存于体内，参与体内的抗氧化和重金属解毒。国内有72%的地区属于低硒地带，其中30%为严重缺硒地带，东北、华北、西北等地的大中城市都属于缺硒地区。在奶牛日粮中添加硒可以提高血液和牛奶中的硒浓度，而富硒牛奶可作为一种富硒食品在日常生活中为人们所食用。朱吉勒[1]在1987年已经报道过了补饲硒-维生素E 对荷斯坦奶牛产奶量的影响。Ceballos等[2]在2009 年已经做过关于硒添加剂对乳硒浓度的Meta分析，但是只局限于酵母硒与亚硒酸钠的对比，但最近十年奶牛的硒添加剂除酵母硒、亚硒酸钠之外，还有羟基蛋氨酸硒、纳米硒、包被亚硒酸钠等多种形式。
Meta 分析，又称荟萃分析，可以综合同类研究结果进行进一步的大样本的统计分析，而传统综述只能转述各研究的结果，并不能统合不同研究间的结果。传统Meta 分析只能进行不用研究间的直接比较，而网状Meta 分析可以同时进行直接与间接比较，即通过相同的对照组来比较没有同时在一个研究中出现的两种或两种以上药物或添加剂。本文为解决传统Meta 分析的局限性及更新总结不同硒添加剂在奶牛生产中的应用效果，采用网状Meta 分析，将硒的形式区分为亚硒酸钠、酵母硒、羟基蛋氨酸硒、纳米硒和包被亚硒酸钠5 种，比较5 种不同硒源对牛奶和血液中的硒浓度、奶牛生产性能和血液抗氧化指标的影响，从而比较不同硒源在奶牛生产中的应用效果。
1 材料与方法
1.1 检索策略
通过在PubMed、Web of Science、谷歌学术等网站检索英文文献，关键词包括Dairy、Cattle、Cow、Ru⁃minant、Milk、Dairy product、Selenium、Selenite、Sele⁃nate、Experiment、Trial、Study 等；在中国知网使用“奶牛”和“硒”作为关键词进行搜索；关于酵母硒和亚硒酸钠，Ceballos 已经做过了对比的Meta 分析，本研究在此基础上继续研究。
1.2 筛选标准
文献的纳入标准：①动物：泌乳期奶牛、胎次、随机分组；②给药方式：口服、剂量、泌乳期给药；③硒的形式：酵母硒或亚硒酸钠或羟基蛋氨酸硒或纳米硒或包被亚硒酸钠；④数据形式：重复数、标准差或标准误、均值；⑤研究指标：乳硒浓度、血硒浓度、产奶量、乳脂率、乳蛋白率、血液谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、血液总抗氧化力（T-AOC）、血液丙二醛（MDA）；①～④项需全部满足，⑤中需要满足其中至少一项。
文献的排除标准：①硒的添加不在泌乳期；②均值、标准差或标准误、重复数缺一项或以上；③包含多种混合因素；④试验动物处于热应激或酸中毒状态；⑤缺少对照组。
1.3 数据提取
由2 位独立的研究者（赵睿和张凯）基于筛选标准对获取的文献进行标题、摘要以及全文的审阅，质疑由另外一位研究者（张伯池）解决。根据设计的“资料提取表”纳入文献中的基本信息，包括第一作者、发表年份、奶牛胎次、奶牛数、剂量、硒的形式、乳硒浓度、血硒浓度、产奶量、乳脂率、乳蛋白率、GSH-Px、TAOC、MDA。
1.4 统计分析
使用R 语言软件分析，网状Meta 分析使用GeMTC包，发表偏倚使用Metafor包进行检验。
在网状Meta 分析中，使用Begg 法检查各研究的发表偏倚，0.05
先假设各研究具有一致性，优先使用固定效应模型，若I2<50%，认为各研究间无显著异质性，进行各组间比较分析；若I2>50%，认为各研究间存在显著异质性，选用随机效应模型；若随机效应模型的I2>50%，则使用不一致模型与一致性模型比较，当两种模型计算所得DIC值（模型拟合残差值）相差<5时，认为各研究间一致，仍然采用一致性模型进行网状Meta 分析；当DIC值相差>5时，认为各研究间存在不一致，采用不一致模型进行网状Meta分析。
2 结果与分析
2.1 文献检索结果
从4个数据库共搜集到1 561篇文献，共有27篇论文符合筛选标准，其中9篇英文文献[3-11]，18篇中文文献[12-29]。共包含亚硒酸钠、包被亚硒酸钠、酵母硒、羟基蛋氨酸硒和纳米硒（硒单质）5种形式。其中有21篇文章统计了乳硒浓度、有19篇文章统计了血硒浓度；有22篇文章统计了产奶量、乳蛋白率和乳脂率；有17篇文章统计了血液GSH-Px活性，10篇文章统计了T-AOC，12篇文章统计了MDA浓度。共包括酵母硒、羟基蛋氨酸硒、亚硒酸钠、包被亚硒酸钠、纳米硒5种硒的形式。
2.2 Meta分析结果
2.2.1 不同硒源对乳硒、血硒浓度的影响
图1为不同硒源对血硒浓度影响的网络关系图，由图1 可知，分析中共有5 种硒源，酵母硒、羟基蛋氨酸硒和包被亚硒酸钠均有与亚硒酸钠直接对比试验，纳米硒组只有与对照组的比较试验。
图1 不同硒源对血硒浓度影响的网络关系
通过Begg 法检验数据的发表偏倚，其P值为0.21，无显著发表偏倚，可以进行网状Meta 分析。网状Meta 分析使用一致性随机效应模型。图2 为网状Meta 分析结果，可以看出，酵母硒组和羟基蛋氨酸硒组的血硒浓度均显著高于对照组（P<0.05），而亚硒酸钠组、包被亚硒酸钠组和纳米硒组的血硒浓度与对照组无显著差异（P>0.05）。亚硒酸钠与包被亚硒酸钠、羟蛋氨酸硒和酵母硒均无显著差异（P>0.05）。
图2 不同硒源对血硒浓度的影响
在羟蛋氨酸硒与对照组的比较中，直接Meta 分析羟基蛋氨酸硒的血硒浓度与对照组无显著差异，而网状Meta 分析则有显著差异，这与分析方法的不同有关。本研究中直接Meta 分析只对一个试验中同时包含羟基蛋氨酸硒和对照组的数据进行分析，而网状Meta分析是综合了所有处理的数据之后，计算产生的效应量[30]，由于网状Meta 所统计的数据更多，其计算的效应量更加保守。
图3结果与图1相同。可以看出分析中共有5种硒源，酵母硒、羟基蛋氨酸硒和包被亚硒酸钠均有与亚硒酸钠直接对比试验，纳米硒组只有与对照组的比较试验。
图3 不同硒源对乳硒浓度影响的网络关系
对乳硒浓度的数据通过Begg法进行发表偏倚检测P=0.59，无显著发表偏倚。网状Meta分析使用一致性随机效应模型。从图4可以看出，酵母硒组和羟基蛋氨酸硒组的乳硒浓度显著高于对照组，且均显著高于亚硒酸钠组（P<0.05）。亚硒酸钠、包被亚硒酸钠和纳米硒组的乳硒浓度与对照组没有显著差异（P>0.05）。
图4 不同硒源对乳硒浓度的影响
选择在一个试验中同时检测了血硒浓度和乳硒浓度的数据做散点图，结果如图5。由图5可知，随着血硒浓度的升高，乳硒浓度也逐渐升高，二者呈现线性正相关，但是，不同形式的硒在血乳之间的转化率各不相同，具体结果见图5。
图5 不同硒的形式在血硒和乳硒之间的关系
2.2.2 不同硒源对产奶量、乳脂率和乳蛋白率的影响图6结果与图1相同。使用Begg法检验产奶量数据的发表偏倚，其P=0.55，无显著发表偏倚。网状Meta分析使用一致性固定效应模型，经计算I2=32%，呈现低异质性，故采用一致性固定效应模型进行Meta 分析。从图7看到，研究中所有添加剂均未显著提高产奶量（P>0.05）。只有羟蛋氨酸硒的直接Meta分析呈现显著提高（P<0.05），但其网状Meta分析并未显著（P>0.05）。图8可以看出其结果与图1相同。在酵母硒对乳脂率的影响中，使用Begg 法检验P=0.71，无显著发表偏倚。使用一致性固定效应模型，经计算I2=32%，呈现低异质性，采用一致性固定效应模型进行Meta 分析。由图9可知，酵母硒组和羟基蛋氨酸硒组的乳脂率显著高于对照组和亚硒酸钠组（P<0.05），亚硒酸钠组、包被亚硒酸钠组和纳米硒组均与对照组没有显著差异（P>0.05）。
图6 不同硒源对产奶量影响的网络关系
图7 不同硒源对产奶量的影响
图8 不同硒源对乳脂率影响的网络关系
图9 不同硒源对乳脂率的影响
图10 可以看出其结果与图1 相同。在酵母硒对乳蛋白率的影响中，使用Begg 法检验P=0.10，无显著发表偏倚。使用一致性固定效应模型，经计算I2=37%，呈现低异质性，采用一致性固定效应模型进行Meta分析。
图10 不同硒源对乳蛋白率影响的网络关系
由图11 可知，日粮中添加酵母硒的乳蛋白含量显著高于对照组和亚硒酸钠组（P<0.05），网状Meta分析时，羟基蛋氨酸硒的乳蛋白含量显著高于对照组（P<0.05）。
图11 不同硒源对乳蛋白率的影响
2.2.3 不同硒源对硒相关抗氧化指标的影响
从图12 可以看出其结果与图1 相同。在酵母硒对GSH-Px 的影响中，Begg 法检验P=0.09，只有轻度发表偏倚，无显著发表偏倚。一致性固定效应模型计算的I2为90%，呈现极高异质性，改用一致性随机效应模型，I2降低到4%，其DIC=72.55，而不一致性类型的拟合DIC=73.20，两者相差<5，且一致性的拟合类型DIC 值更低，选用一致性随机效应模型进行Meta 分析。由图13可知，酵母硒组的血液GSH-Px的活性显著高于对照组和亚硒酸钠组（P<0.05）。
图12 不同硒源对GSH-Px活性影响的网络关系
图13 不同硒源对GSH-Px活性的影响
图14 为不同硒源对T-AOC 影响的网络关系，从图14 中可以看出只有酵母硒、羟基蛋氨酸硒和亚硒酸钠三种硒的形式在试验中检测了T-AOC，酵母硒与羟基蛋氨酸硒没有直接比较的试验。
图14 不同硒源对T-AOC影响的网络关系
在酵母硒对TAOC 的影响中，使用Begg 法检验，其P<0.01，具有极显著发表偏倚，然后从漏斗图观察数据点，在去除偏离最大的两组试验数据后，经Begg法检验，P=0.06，已无显著差异，之后使用一致性类型随机效应模型计算，I2=13%，异质性较低，选用一致性随机效应模型进行Meta 分析。由图15 可知，在网状Meta 分析下，只有酵母硒组的T-AOC 显著高于对照组（P<0.05），羟基蛋氨酸硒组和酵母硒组的T-AOC均显著高于亚硒酸钠组（P<0.05）。
图15 不同硒源对T-AOC的影响
图16 为不同硒源对T-AOC 影响的网络关系图，从图中可以看出只有酵母硒、羟蛋氨酸硒和亚硒酸钠三种硒的形式在试验中检测了T-AOC，酵母硒与羟基蛋氨酸硒没有直接比较的试验。
图16 不同硒源对MDA影响的网络关系
在酵母硒对MDA的影响中，Begg法检验P=0.07，有轻度发表偏倚，但是并无显著发表偏倚。经计算，固定效应模型下I2=78%，呈现高异质性，之后改用一致性类型随机效应模型，I2降低到9%。由图17 可知，酵母硒组的MDA 浓度显著低于对照组和亚硒酸钠组（P<0.05），其余组间的MDA 浓度无显著差异（P>0.05）。
图17 不同硒源对MDA的影响
3 讨论
3.1 日粮添加不同形式硒对乳硒浓度和血硒浓度的影响
酵母硒中主要为硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸，硒代氨基酸与氨基酸使用相同的转运载体，在肠道通过主动吸收进入体内，而亚硒酸钠和羟基蛋氨酸硒都以被动扩散的形式在小肠吸收，且吸收率约为酵母硒的一半[31]，所以包被亚硒酸钠和羟基蛋氨酸硒的血硒浓度效应量相似，且均低于酵母硒组。亚硒酸钠、纳米硒在瘤胃中被转化为其他不易被溶解和吸收[32]的硒盐形式，进一步降低了机体对硒的吸收率，所以亚硒酸钠组、纳米硒组的效应量均较低。
氨基酸硒（酵母硒、羟基蛋氨酸硒）在进入机体后，可以直接通过氨基酸的转运途径[33]运输到各个需要的组织，进而结合到硒蛋白或者含硒蛋白中，并通过血液运输到身体各部位。但是，无机硒（包括亚硒酸钠、纳米硒）在进入血液之后需要消耗3 个还原型辅酶Ⅱ（NADPH）被还原成硒化氢才能参与体内的硒代谢。硒进入机体后主要以硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸结合在蛋白质中。硒化氢转化为硒代半胱氨酸需要氢受体和丙氨酸的参与，并消耗三磷酸腺苷（ATP），最后在硒代半胱氨酸裂合酶的催化下生成硒代半胱氨酸和氢供体；硒化氢转化为硒代蛋氨酸则需要经过两步反应，首先硒化氢由S-腺苷蛋氨酸还原为甲基硒醇，然后甲基硒醇在胱硫醚γ裂合酶的催化下与氨和2-酮丁酸生成硒代蛋氨酸和水。最后两种硒代氨基酸通过mRNA的翻译机制组成含有硒的蛋白质。
从乳硒浓度的分析结果可以看出，羟基蛋氨酸硒和酵母硒组的乳硒浓度显著高于对照组和亚硒酸钠组。奶牛乳蛋白主要由乳腺组织摄取乳动脉血液中的氨基酸合成。血液中的硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸分别由半胱氨酸和蛋氨酸的密码子识别并进入蛋白质。血液中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸比例越高，含硒氨基酸才能有更高的概率结合进乳蛋白中，乳硒的含量才会越高。故而同种硒添加剂的血硒浓度与乳硒浓度成正比，与图5结果相印证。
由图5可知，不同硒的形式在血乳转移中有不同的效率，羟基蛋氨酸硒的效率最高，酵母硒次之，亚硒酸钠最低。不同形式的硒添加剂被机体吸收后，并不都以氨基酸硒的形式存在于血液中。如亚硒酸钠进入体内后除了转化为硒代氨基酸外还可以形成各种硒化合物，如甲基硒酸、硒磷酸、三甲基硒、1-甲基硒-N-乙酰-D-半乳糖胺等，转化为硒代氨基酸和进入乳蛋白的比例逐级降低。酵母硒中硒代氨基酸的含量超过90%，在体内可以迅速参与各种代谢，但半胱氨酸在牛奶中的比例较低，硒代半胱氨酸主要通过谷胱甘肽过氧化物酶参与体内的抗氧化反应。羟基蛋氨酸硒在进入奶牛体内后迅速转化为硒代蛋氨酸。在乳蛋白中，蛋氨酸的含量一般为半胱氨酸的7 倍以上，所以相比于半胱氨酸，硒代蛋氨酸可以更多地结合在乳蛋白中，故而奶牛中羟基蛋氨酸硒的血乳转化率要高于酵母硒。
3.2 日粮中添加不同形式的硒对奶牛生产性能的影响
从Meta 分析结果可以看出，产奶量、乳脂率和乳蛋白率在不同试验之间的异质性均较低，说明在不同试验在生产性能的测定方面均较为一致，所得数据可以直接比较。从结果可以看出酵母硒和羟基蛋氨酸硒的添加可以使日产奶量提高1 kg以上，乳脂率提高0.1%以上，乳蛋白率提高约0.1%。蛋氨酸是奶牛的第一或第二限制性氨基酸，在日粮中添加0.3 mg/kg的蛋氨酸硒（以硒计）相当于额外添加了约0.57 mg/kg的蛋氨酸，且羟基蛋氨酸硒的添加效果与酵母硒类似。补充日粮中的限制性氨基酸，提高氨基酸平衡有利于奶牛泌乳性能的发挥，进而提高产奶量和乳蛋白合成量。所以奶牛的产奶量和乳蛋白率均有提升，这一结果与许多研究结果相同[17，19，21，34]。
亚硒酸钠、包被亚硒酸钠和纳米硒对乳蛋白率和乳脂率均无显著影响，且效应量接近于零，说明无机硒对乳脂率和乳蛋白率的影响不大。在硒的代谢中没有与乳蛋白和乳脂合成有关的通路，所以简单增加硒的含量并不会影响乳蛋白率和乳脂率。
3.3 日粮中添加不同形式硒对硒相关抗氧化指标的影响
GSH-Px 是一种含硒蛋白酶，日粮中添加硒可以提高血硒浓度，进而提高GSH-Px 的活性。GSH-Px的活性中心为硒代半胱氨酸，所以GSH-Px 活性与硒代半胱氨酸的浓度相关性较大。在酵母硒中，除含有大量的硒代蛋氨酸之外，还有少量的硒代半胱氨酸。硒代半胱氨酸可以直接进入并活化GSH-Px，而蛋氨酸和亚硒酸钠均需首先转变为硒代半胱氨酸之后才能活化GSH-Px，所以酵母硒组的GSH-Px 活性显著高于对照组和亚硒酸钠组。
大部分研究结果证明日粮中添加硒可以提高T-AOC[33]。酵母硒被吸收后，可以直接与硒蛋白结合从而发挥作用，不会消耗体内的还原力，而亚硒酸钠在被吸收进入机体后，首先需要消耗机体还原能NADPH，生成硒化氢，然后才能转化为硒代半胱氨酸，并与GSH-Px 结合发挥抗氧化的作用。亚硒酸钠转化为硒化氢的代谢过程说明过多添加亚硒酸钠对奶牛的T-AOC 有潜在的降低风险，这与分析结果相一致，网状Meta 分析中亚硒酸钠组的T-AOC 效应量呈现轻微降低，且酵母硒和羟基蛋氨酸硒添加组的T-AOC都显著高于亚硒酸钠组。
GSH-Px 作为还原酶，可以降低体内过氧化反应的产物，所有添加了硒的试验组GSH-Px 活性效应量均高于对照组，所以硒添加组的MDA 浓度都低于对照组，与其他的研究结果相同[28]。
4 结论
通过本试验的分析可以得出，在所有的硒添加剂种类中，酵母硒对血硒浓度、乳硒浓度、生产性能和抗氧化指标的提高最多也最确定；羟基蛋氨酸硒对血硒浓度、乳硒浓度和生产性能的提高要弱于酵母硒；三种无机硒的应用效果均弱于酵母硒和羟基蛋氨酸硒，包被亚硒酸钠效果优于亚硒酸钠，但是包被亚硒酸钠只有一个试验，分析数据样本小，结果可靠性较低，需要以后更多的试验验证结果；亚硒酸钠和纳米硒对血硒浓度、乳硒浓度、生产性能和相关抗氧化指标均没有显著影响。
