从三七渣和三七废液中提取的三种成分在不同浓度下的体外细胞抗肿瘤活性筛选＊

顾龙龙 梁璇 黄霞 单妍 范戎

三七为五加科植物三七的干燥根，主产于云南、广西及四川等地，其味甘、微苦，性温，归肝、肾经，具有散瘀止血、消肿止痛的功效[1-2]，是我国珍贵的特产药材和常用中药。国内外多年来对三七的研究，主要集中在水溶性皂苷成分[3]，三七中的许多其他的成分，如三七多糖类、三七素、黄酮、挥发油、氨基酸及各种微量元素等[4]，随着研究手段和分离技术的不断发展也被分离出来，具有重要的药用价值[5]。为了最大限度地利用和节约三七资源，本实验在前期实验研究的基础上，进一步将提取皂苷过程中产生的大量三七渣和三七废液充分利用，分离出3种三七提取物，进行了体外细胞抗肿瘤活性筛选实验并探讨其在抗肿瘤方面的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与细胞株

仪器：HFC386STD-V12型超低温冰箱（德国Hereaus公司），CO2孵育箱（德国Heraeus公司），YJ-1450型紫外超净工作台SW-CJ-IF（苏州安泰空气技术有限公司），METTLER AE240型电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司），Biorad MODEL 680型BH-2型酶标仪（美国 Bio-rad公司），1.0R型低温高速离心机（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。

试剂：RPMI1640培养液（Gibco公司），新生牛血清（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），PBS袋装预混合试剂（康为生物有限公司），二甲基四氮唑盐（MTT）（Sigma公司），生理盐水（昆明南疆制药有限公司），无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂），三七脂溶性成分（云南省云科药业有限公司，批号：20181018），三七水溶性成分（云南省云科药业有限，批号：20181018），含三七素的提取物（云南省云科药业有限公司，批号：20181018）。

细胞株：人肝癌细胞株HepG2，人皮肤黑色素瘤细胞株A375，人结肠癌细胞株HCT-116，人胃癌细胞株SGC-7901，人肺癌细胞A549。保存于昆明医科大学云南省天然药物药理重点实验室。

1.2 药物及试剂配制

1.2.1 药物的配制 三七水溶性提取物：称取三七水溶性提取物，用含10%牛血清的1640培养基溶解，取得浓度为10 mg/ml的药液并用0.22 μm无菌滤头过滤备用。

三七脂溶性提取物：称取三七脂溶性提取物，用含10%牛血清的1640培养基溶解，取得浓度为10 mg/ml的药液并用0.22 μm无菌滤头过滤备用。

含三七素提取物：称取含三七素的提取物，用含10%牛血清的1640培养基溶解，取得浓度为10 mg/ml的药液并用0.22 μm无菌滤头过滤备用。

1.2.2 试剂的配制 （1）MTT 溶液配制：5 mg MTT粉末， 加 入 1 ml PBS 配成 5 mg/ml浓 度 的溶液。（2）三联液配制：配置含 0.012 mol/L HCl、10%十二烷基硫酸钠（SDS）、5%异丁醇的三联液，即加 1.2 ml 36%～37% 浓盐酸、100 g SDS、50 ml异丁醇，用1 L三蒸水溶解后备用。

1.3 改良MTT法

参照文献[6-8]采用改良MTT（MTS）法对5种肿瘤细胞进行体外抑瘤药理活性筛选。实验采用常规细胞培养法培养细胞。取对数生长期的各肿瘤细胞，计数后调细胞浓度为6×104个/ml，接种于96孔板。给药组、空白组各设10个平行孔，每孔 各 80 μl。 将 母 液 按 1、2、4、10、100、1 000倍稀释为 10 mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml的药液。CO2培养箱培养 24 h后给药组每10孔加入一种浓度药液20 μl，使作用于细胞的终浓度为 2 mg/ml、1 mg/ml、500 μg/ml、200 μg/ml、20 μg/ml、2 μg/ml，空白组加入每孔20 μl含10%牛血清的1640培养基。加药后在37 ℃，5% CO2及饱和湿度培养箱中培养 24 h后，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/ml）20 μl，继续培养 4 h，每孔加入100 μl三联液充分溶解，8～12 h后，用酶标仪在双波长（570、630 nm）下测定各孔的OD值并用SPSS 17.0统计分析。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 三七提取物对人肝癌细胞HepG2实验

（1）含三七素的三七提取物各给药组对人肝癌细胞株HepG2的药理学活性OD值与空白组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各给药组对人肝癌细胞株HepG2的药理学活性OD值与空白组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物浓度为 2 mg/ml的给药组对人肝癌细胞株HepG2的药理学活性OD值低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），能抑制细胞生长，见表1。

表1 不同浓度三七提取物对人肝癌细胞株HepG2的药理学活性OD值比较（±s）

表1 不同浓度三七提取物对人肝癌细胞株HepG2的药理学活性OD值比较（±s）

*与空白组比较，P＜0.05。

组别 药物浓度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素给药组（n=10） 2 mg/ml 0.004 0±0.002 1* 0.266 2±0.027 8 0.227 8±0.015 2 1 mg/ml 0.265 7±0.055 1 0.287 2±0.010 6 0.231 0±0.010 1 500 μg/ml 0.264 7±0.021 9 0.283 4±0.008 5 0.248 5±0.016 1 200 μg/ml 0.280 8±0.009 5 0.257 6±0.006 4 0.229 3±0.019 2 20 μg/ml 0.259 8±0.006 6 0.261 5±0.013 3 0.234 4±0.010 2 2 μg/ml 0.246 4±0.012 0 0.263 9±0.063 4 0.233 5±0.017 5空白组（n=10） 0.262 2±0.011 8 0.268 9±0.015 1 0.245 4±0.006 8

2.2 三七提取物对人结肠癌细胞HCT-116实验

（1）含三七素的三七提取物各给药组对人结肠癌细胞株HCT-116的药理学活性OD值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各给药组对人结肠癌细胞株HCT-116的药理学活性OD值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物对人结肠癌细胞株HCT-116在不同的浓度具有不同的药理作用：浓度为 2 mg/ml、1 mg/ml的给药组 OD 值均低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），能抑制细胞生长，2 mg/ml抑制作用最明显，其次是 1 mg/ml；浓度为500 μg/ml、200 μg/ml的给药组OD值高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），可促进细胞生长，500 μg/ml促进作用最明显，其次是200 μg/ml，见表2。

表2 三七提取物对人结肠癌HCT-116的药理学活性OD值比较（±s）

表2 三七提取物对人结肠癌HCT-116的药理学活性OD值比较（±s）

*与空白组比较，P＜0.05。

组别 药物浓度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素给药组（n=10） 2 mg/ml 0.001 1±0.000 3* 0.304 9±0.021 6 0.266 2±0.027 8 1 mg/ml 0.061 7±0.014 8* 0.318 4±0.013 4 0.287 3±0.010 6 500 μg/ml 0.313 2±0.011 5* 0.317 5±0.011 7 0.283 4±0.008 7 200 μg/ml 0.285 7±0.024 6* 0.301 0±0.005 7 0.257 6±0.006 6 20 μg/ml 0.255 0±0.015 0 0.301 1±0.005 8 0.261 5±0.013 3 2 μg/ml 0.253 0±0.014 2 0.299 6±0.013 9 0.263 9±0.006 4空白组（n=10） 0.266 2±0.007 5 0.307 0±0.005 3 0.268 9±0.151 1

2.3 三七提取物对人胃癌细胞SGC-7901实验

（1）含三七素的三七提取物各给药组对人胃癌细胞株SGC-7901药理学活性OD值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各给药组对人胃癌细胞株SGC-7901药理学活性OD值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物对人胃癌细胞株SGC-7901在不同的浓度具有不同的药理作用：浓度为2 mg/ml、1 mg/ml的给药组OD值低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），能抑制细胞生长，2 mg/ml抑制作用最明显，其次是 1 mg/ml；而在为 500 μg/ml、200 μg/ml的给药组OD值高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），能促进细胞生长，500 μg/ml促进作用最明显，其次是200 μg/ml，见表3。

表3 三七提取物对人胃癌细胞株SGC-7901的药理学活性OD值比较（±s）

表3 三七提取物对人胃癌细胞株SGC-7901的药理学活性OD值比较（±s）

*与空白组比较，P＜0.05。

组别 药物浓度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素给药组（n=10） 2 mg/ml 0.006 5±0.002 2* 0.251 3±0.012 6 0.228 2±0.035 9 1 mg/ml 0.106 0±0.042 8* 0.250 1±0.016 7 0.210 2±0.022 7 500 μg/ml 0.288 7±0.019 7* 0.250 6±0.010 0 0.230 7±0.007 1 200 μg/ml 0.252 7±0.013 1* 0.262 8±0.013 7 0.252 7±0.012 7 20 μg/ml 0.246 1±0.007 1 0.235 7±0.007 7 0.217 2±0.005 5 2 μg/ml 0.243 8±0.013 1 0.224 5±0.006 5 0.225 8±0.009 0空白组（n=10） 0.239 2±0.010 5 0.228 7±0.009 6 0.239 2±0.007 4

2.4 三七提取物对人皮肤黑色素瘤细胞A375实验

（1）含三七素的三七提取物各给药组对人皮肤黑色素瘤细胞株A375药理学活性OD值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各给药组对人皮肤黑色素瘤细胞株A375药理学活性OD值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物对人皮肤黑色素瘤细胞株A375具有抑制生长的药理作用：浓度为2 mg/ml、1 mg/ml的给药组OD值低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），能抑制细胞生长，见表4。

表4 三七提取物对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的药理学活性OD值比较（±s）

表4 三七提取物对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的药理学活性OD值比较（±s）

*与空白组比较，P＜0.05。

组别 药物浓度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素给药组（n=10） 2 mg/ml 0.007 8±0.002 6* 0.300 7±0.004 3 0.283 0±0.008 7 1 mg/ml 0.129 5±0.019 3* 0.291 1±0.013 8 0.277 4±0.005 8 500 μg/ml 0.256 2±0.008 5 0.291 2±0.007 8 0.273 4±0.011 9 200 μg/ml 0.273 9±0.010 3 0.289 1±0.013 2 0.274 2±0.010 1 20 μg/ml 0.261 0±0.005 6 0.283 8±0.009 1 0.274 0±0.006 6 2 μg/ml 0.260 2±0.005 8 0.286 3±0.004 5 0.277 1±0.007 5空白组（n=10） 0.265 1±0.003 7 0.295 2±0.011 0 0.277 7±0.003 5

2.5 三七提取物人肺癌细胞A549实验

（1）含三七素的三七提取物各给药组对人肺癌细胞株A549药理学活性OD值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各给药组对人肺癌细胞株A549药理学活性OD值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物对人肺癌细胞株A549在不同的浓度具有不同的药理作用：浓度为2 mg/ml的给药组OD值低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），可抑制细胞生长；而浓度为 1 mg/ml、500 μg/ml、200 μg/ml的给药组OD值高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），可促进细胞生长，1 mg/ml促进作用最明显，见表5。

表5 三七提取物对人肺癌细胞株A549的药理学活性OD值比较（±s）

表5 三七提取物对人肺癌细胞株A549的药理学活性OD值比较（±s）

*与空白组比较，P＜0.05。

组别 药物浓度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素给药组（n=10） 2 mg/ml 0.050 4±0.012 2* 0.291 7±0.008 5 0.287 3±0.010 6 1 mg/ml 0.458 3±0.033 8* 0.299 8±0.015 8 0.283 1±0.005 6 500 μg/ml 0.381 6±0.031 9* 0.293 6±0.004 5 0.272 7±0.016 5 200 μg/ml 0.310 2±0.012 9* 0.287 6±0.008 5 0.274 2±0.009 8 20 μg/ml 0.287 4±0.010 7 0.288 0±0.004 7 0.270 3±0.004 4 2 μg/ml 0.282 0±0.007 5 0.295 2±0.008 5 0.269 0±0.005 2空白组（n=10） 0.283 1±0.008 9 0.294 3±0.007 3 0.278 0±0.010 6

3 讨论

三七资源的综合利用，能最大限度地提高三七资源的利用率，变废为宝，更能增加企业经济效益。国内学者在筛选植物抗肿瘤活性成分时发现，三七醇提物的石油醚部位对结肠癌细胞株及部分革兰阳性菌有强烈的抑制活性[9]，对线虫具有降脂作用[10]，对溃疡性结肠炎具有改善作用[9]，通过对分离得到的化合物光谱分析分别鉴定为人参炔醇（panax ynol，Ⅰ）、人参环氧炔醇（panax ydol，Ⅱ）和B-谷甾醇（B-sitosterol，Ⅲ）。而关于三七素的研究主要集中在止血作用和抗脂解与促进脂肪合成作用[11-13]。近年来三七多糖的研究也日益受到人们的关注，有研究表明，三七多糖具有免疫调节作用[14]，国内外近期研究也主要集中于三七多糖对机体免疫功能方面上的影响。陈新霞等[15]研究发现三七多糖能改善小鼠免疫功能调节；张朝贵等[16]发现三七多糖能影响创伤大鼠CD4+/CD8+和白细胞介素-2水平。

对本实验结果统计分析可发现一定的规律，对于贴壁细胞（HepG2、A375、A549、SGC-7901、HCT-116），三七脂溶性成分在高浓度时具有明显的抑制细胞增殖作用，这与脂溶性成分对结肠癌细胞株及部分革兰阳性菌有强烈的抑制活性的报道相一致；三七脂溶性成分在中浓度一般具有明显的促进细胞增殖的作用。而富含三七素的三七提取物与水溶性的三七提取物对肿瘤细胞活性的影响不大，这对三七资源的进一步研究和利用将具有重要的指导意义。