核桃蛋白的制备、特性及研究进展

王青华，路 敏，邢世松，王雅宁，李喜层

核桃蛋白的制备、特性及研究进展

王青华1,2，路 敏1a，邢世松1a，王雅宁1b，李喜层1b

（1. 河北养元智汇饮品股份有限公司 a. 河北省核桃营养功能与加工技术重点实验室，b. 河北省核桃饮品技术创新中心，河北 衡水 053000；2. 衡水学院 生命科学学院，河北 衡水 053000）

论述了核桃蛋白的开发利用、分离提取、核桃蛋白的结构以及特性等。重点分析了以核桃蛋白为原料制备而得的核桃肽的研究与发展，包括其制备方法以及核桃肽功能活性等。

核桃蛋白；核桃肽；功能活性

核桃原产于欧洲东南部、东亚和北美洲，是世界上最广泛种植的坚果，自汉代起传入我国，至今已有1700多年的栽培历史，目前我国是世界上最大的核桃生产国。核桃是一种分布广泛，资源丰富的坚果。核桃是一种极好的高能量食物来源，每100克核桃仁供应630千卡的热量，主要是由于核桃仁重量的84%是由两大产能营养素组成（蛋白质24%和70%脂类）[1]。

核桃作为一种健康食品受到越来越多的关注，据报道，经常食用核桃可以降低患冠心病的风险[2]。因此，核桃可以作为许多食品的配料，如面包制品，以提高产品的营养价值和感官特性[3]。核桃油是核桃制品中的主要产品，也是沙拉酱和烹饪用的重要特种油脂之一[4]。过去的研究表明，核桃中油脂的含量高达62%～68%，其中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的含量最高[5]，从而在降低胆固醇方面具有明显的优势。除核桃油外，核桃还含有24%的蛋白质、12%～16%的碳水化合物、1.5%～2.0%的纤维素和1.7%～2.0%的矿物质[6]。

核桃蛋白由于其营养价值高、成本低、功能特性好等优点，已成为人们关注的重点植物蛋白资源。为了充分利用核桃蛋白质资源，并提高它的经济价值，需要全面了解核桃蛋白质的组成和特性，本文主要综述了核桃蛋白的研究进展，重点阐述了核桃蛋白的结构与功能方面的研究进展，期盼能为我国核桃蛋白的深度开发提供一定的理论基础和研究方向，为今后核桃蛋白及其相关产品的进一步研究奠定基础。

1 核桃蛋白的提取

1.1 核桃蛋白的分类和组成

参照Osborne等人的提取方法[7]，根据核桃蛋白在不同溶剂中溶解性的差异将其分为以下四类蛋白：溶于水的清蛋白、溶于盐的球蛋白、溶于乙醇的醇溶蛋白、溶于NaOH的谷蛋白。据Sze-Tao[8]报道，核桃蛋白可分为四类：清蛋白（6.8%）、球蛋白（17.6%）、醇溶蛋白（5.3%）和谷蛋白（70.1%）。由于核桃品种的差异，其中所含的上述四类蛋白的配比各不相同，但谷蛋白和球蛋白含量一般都是最高的。毛晓英[9]对核桃蛋白的组成进行了提取和分析，得到的四种核桃蛋白的含量分别是清蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白的含量分别是7.54%、4.73%、72.06%、15.67%，由此可见，谷蛋白和球蛋白的含量明显高于其它蛋白组分。

1.2 核桃蛋白的提取

1.2.1 核桃总蛋白的提取

目前，核桃总蛋白的提取方法主要有碱溶酸沉法、盐析法、反胶束法、超声波辅助法、膜分离法以及离子交换法等。

（1）碱溶酸沉法

碱溶酸沉法是核桃总蛋白的制备应用最广泛的方法，利用核桃蛋白与其它组分的酸碱性差异对核桃蛋白进行提取的。

主要的制备工艺为：

制备原理为：将核桃粕溶于碱液中，目的是为了除去其中含有的不溶性杂质，将蛋白质从溶液中分离出来，接下来，用酸将溶液pH调至核桃蛋白的等电点，使核桃蛋白沉淀，冷冻离心，将沉淀水洗至中性，最后收集沉淀，最终获得核桃分离蛋白。

此方法简单易行，实验成本低，且具有较为成熟的提取工艺，但酸碱消耗量较大，易造成环境污染，蛋白质的提取率较低（44.5%～63.7%），感官上表现为颜色偏深。

（2）超声波辅助法

为改善碱溶酸沉法提取率较低、耗时长等缺陷，近年来超声波辅助提取技术逐步应用于植物蛋白的提取，该法可有效提高蛋白的提取效率。敬思群[10]以碱溶酸沉法为基础并辅助超声波法提取核桃蛋白，通过响应面法优化确定最佳的提取工艺，此条件下核桃蛋白的提取率提高到68.98%。李婷等[11]以核桃粕为原料，以超声波辅助技术研究了核桃蛋白的提取工艺，运用响应面法优化提取工艺参数，最终将核桃蛋白的提取率提高至80.56%。

（3）反胶束法

1943年霍尔、舒克曼共同提出反胶束的方法，在20世纪80年代引入国内并展开广泛的研究。自90年代以来，反胶束萃取法越来越引起许多研究者们的广泛关注，并得到了迅猛发展。相关研究者为将该法用于植物蛋白的提取中进行了努力的研究，并取得显著的成绩。反胶束萃取的原理在于表面活性剂在一定浓度下可形成反胶束，用来溶解蛋白质，从而可将其从水相向有机相萃取。该方法的优点在于工艺条件温和，从而可以减少蛋白失活或变性的程度。

Haifang Hu[12]等对比了用反胶束法和传统的碱溶酸沉法从脱脂核桃粕中提取的核桃蛋白，研究发现，反胶束法的萃取率高于碱溶酸沉法，且制备的蛋白质的功能性质，如溶解度、乳化性、起泡能力、持水及持油能力均较高，且反胶束体系造成了核桃蛋白的二级结构（α-螺旋、β-折叠、无序结构、β-转角）的减少和侧链结构的增加，这可能是引起功能出现差异的原因之一。王宪昌[13]等人研究了反胶束法对提取核桃蛋白率的影响，并与传统的碱溶酸沉法进行对比，结果发现，反胶束法可以有效的提高蛋白的提取率，使核桃蛋白的前萃取率达到83.29%，明显高于碱溶酸沉法63.7%的萃取率。

目前，国内外学者虽然利用反胶束技术萃取植物蛋白的研究成果较多，但利用该技术萃取核桃蛋白方面的应用还不甚成熟与深入，国内外学者还需进一步在核桃蛋白萃取方面进行更深入的研究与探索。

（4）亚临界萃取法

亚临界水萃取法是近年来新兴的一种萃取方法，以亚临界水为萃取剂，通过改变压力，使水的温度达到100～373 ℃之间，并保持水为液态[14]。与普通常温水相比，亚临界水的应用可大大提高极性较低物质的溶解度，进而提高萃取率，而且还能大大缩短提取时间，提高了提取效率，但由于温度过高，很容易使蛋白质降解[15]。

目前，有关亚临界水萃取核桃蛋白的研究还较少，如汪正兴[16]等人以新疆核桃粕为原料，利用亚临界水萃取法提取核桃蛋白，通过响应面法优化确定最佳提取工艺，核桃蛋白的提取率可达75.01%，明显高于碱溶酸沉法的提取率。

1.2.2 核桃蛋白的分级提取

21世纪初，Osborne首次根据蛋白质溶解性的不同而对小麦蛋白进行了分级提取，依次获得了清蛋白（Albumin）、球蛋白（Globulin）、醇溶蛋白（Prolamin）和谷蛋白（Glutelin）四种组分。随后，研究者们便参照他的试验方法陆续对核桃蛋白进行了分级提取，如Sze-Tao[8]等参照Osborne的方法分级提取核桃蛋白，依次得到了6.8%的清蛋白、17.6%的球蛋白、5.5%的醇溶蛋白和70.1%的谷蛋白。毛晓英等利用相同的方法对核桃蛋白进行分级提取，也得到了基本相同的结果。核桃蛋白分级提取与其它植物蛋白分级提取存在同样的问题，根据在不同溶剂中溶解性的不同进行提取时，如果前一级提取不彻底的话，很容易到了下一级蛋白提取，因此容易引起不同分级蛋白的交叉，因此，每一级蛋白的提取应采用多次提取的方式，以尽可能提取彻底。

由此，我们可以得知核桃蛋白中，含量最高的是谷蛋白和球蛋白。上述方法是用稀碱提取的谷蛋白，由于谷蛋白还可溶于稀酸中，目前用稀酸提取核桃谷蛋白的研究非常少，仅发现金子纯[17]分别用稀酸（50%冰乙酸）和稀碱（0.1M NaOH）提取谷蛋白，分别得到酸性谷蛋白（谷蛋白-1）和碱性谷蛋白（谷蛋白-2）。进一步对酸溶谷蛋白和碱溶谷蛋白的结构及功能性质的研究也甚少，尤其是酸溶性谷蛋白，有待于进一步深入研究酸溶性谷蛋白的结构及功能性质等。

2 核桃蛋白的特性

蛋白质特性（如溶解性、乳化性、起泡性、持水和持油的能力以及胶凝性和粘性等）是其在食品加工中发挥特定功能的基础。目前，核桃蛋白功能特性的研究大部分都是针对核桃总蛋白而言的[18]，溶解度主要受溶剂、温度、pH值等条件的影响；乳化性主要受蛋白浓度和温度等条件的影响；乳化性与溶解性呈现一定的正相关的关系，同时受到酸碱度和盐离子浓度的影响，此外还受到自身浓度和外界温度的影响；起泡性和泡沫稳定性主要受pH值、盐浓度、蔗糖等因素的影响；

溶解性是评价蛋白质质量的重要参数，也是蛋白质发挥其它功能性质的前提和基础。溶解度良好的蛋白，可以更好地促进其在蛋白饮料生产中的应用。

吸油性是反映与脂类结合的能力，使其可以更好地用于肉类制品加工中。可以作肉制品添加剂和填充剂。Mao[19]等的研究结果表明，核桃分离蛋白具有良好的吸油性，且温度是主要影响因素，随着温度的升高，吸油性的变化趋势为先降低后增高。在肉制品和烘焙食品中，蛋白质的持水性发挥着至关重要的作用。Mao等还研究了核桃分离蛋白和核桃粉的持水性，主要影响因素为pH值和NaCl浓度；此外，还有学者研究了核桃蛋白的粘性及其影响因素主要为温度[20]。蛋白质的吸油性和吸水性对于确定食品的质地特性（例如多汁性，口感和嫩度）是至关重要的。

至今，有关核桃蛋白中各蛋白组分-清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白各自功能性质的研究还很少，金子纯[17]对上述分级后的核桃蛋白组分的功能性质进行了初步研究，发现：几类核桃蛋白组分的溶解性整体偏差，只有清蛋白稍好。溶解性不佳的原因可能是受核桃原料中多酚和丹宁物质存在的影响，但这有待于进一步研究和探索。核桃几类蛋白均具有较好的乳化性，其中谷蛋白-2（碱性谷蛋白）乳化性最高，其次是清蛋白；球蛋白的乳化稳定性最高，有助于其在食品加工中作为乳化剂。起泡性决定着食品中许多甜品和饮品的质量，是食品工业生产中重要的功能指标，谷蛋白-2（碱性谷蛋白）和球蛋白表现出良好的起泡特性。邓欣伦[21]研究了核桃蛋白及其主要组分谷蛋白和球蛋白的物化特性与功能特性。得到的主要结论为：核桃蛋白的热稳定性和二硫键的含量均高于谷蛋白和球蛋白；谷蛋白和球蛋白的巯基含量高于核桃蛋白；谷蛋白的乳化活性高于核桃蛋白和球蛋白。

还有文献报道蛋白的制备方法不同，对其功能性也有一定的影响。汪正兴[22]研究了通过超声波法与亚临界水法提取蛋白的功能性的差异。

3 核桃蛋白的结构研究

根据结构决定功能的原理，为了更好地充分利用核桃蛋白这一重要的植物蛋白资源，将其更好地应用于食品加工中，需要全面了解核桃蛋白组分的结构与功能之间的关系。目前国内外学者对核桃蛋白的结构已经做了一些研究，但还不够系统和深入[23]，Mao[24]等分析了核桃蛋白各组分的氨基酸组成、分子量分布及其亚基组成的分布，结果表明，清蛋白、球蛋白和谷蛋白的亚基分布主要集中于14.4～66.2 kDa范围内。2-DE结果显示，核桃蛋白组分的等电点集中在4.8～6.8。分子排阻色谱法结果显示，核桃蛋白主要组分的分子量集中在3.54～81.76 kDa之间。毛晓英[9]通过圆二色谱（CD）光谱技术研究了核桃蛋白的二级结构构象，结果表明，核桃蛋白包含了α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲等四种类型的二级结构，其中以α螺旋和无规则卷曲较多。

核桃蛋白作为一种优良的植物蛋白，具有较宽范围的分子量分布和多个亚基组成，可以进一步将核桃蛋白中不同分子量的不同亚基分离纯化，进一步深入研究核桃蛋白的结构，通过CD光谱法考察蛋白质的二级结构等，可为将核桃蛋白作为辅料（如蛋糕，冰淇淋和甜点等食品）添加于不同食品中或在食品加工业中以新产品的形式出现打下坚实的理论基础，因此，加深对核桃蛋白的相关结构的研究具有重要的理论和实践意义。

4 核桃蛋白的应用

核桃蛋白中富含活性肽的功能片段，此类化合物分子量小，无需消化可直接被人体吸收利用，因此目前核桃蛋白精深加工的主要方向是以核桃粕为主要原料提取核桃蛋白制备核桃肽。

4.1 核桃肽的制备方法

目前，核桃肽的主要制备方法是酶法和发酵法。鉴于酶具有专一性、高效性和温和性等优点，酶解法成为应用最广泛、最成熟的制备方法。酶解法主要是利用各种蛋白酶将核桃蛋白水解产生多肽，常用的酶主要有中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及复合蛋白酶。

酶解法中确定酶解条件是最重要且最需要解决的问题，包括加酶量、酶解温度、酶解时间、pH值、料液比等。喻峰[25]等选用复合蛋白酶与风味蛋白酶对核桃粕进行水解制备了核桃多肽，确定的最优工艺条件为：酶解温度55 ℃、pH值5.5、酶解时间4 h、料液比1∶5、加酶量为0.3%。包怡红[26]等用四种蛋白酶分别对核桃蛋白进行酶解，结果表明，风味蛋白酶酶解作用效果最好。

发酵法制备多肽是当前活性肽制备的热点研究方向，主要是利用微生物的发酵作用来分解蛋白质，此法需要注意的主要问题是控制和确定影响发酵作用的主要影响因素，如菌种选择、接种量、发酵时间、发酵温度和pH值等。梁杏[27]等以核桃粕为原料，进行了液态发酵法制备核桃多肽的相关研究，采用的菌种为枯草芽孢杆菌、纳豆枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，结果发现，发酵96 h后，枯草芽孢杆菌效果最好，可以更好地将核桃粕中的蛋白质分解为游离氨基酸和多肽。谢翠品[28]等利用黑曲霉液态发酵核桃粕制备核桃多肽，经响应面实验优化确定的最佳发酵条件为：发酵温度为30 ℃，发酵时间48 h，摇床转速为200 r/min，核桃粕浓度7%，接种量为11%。发酵法与酶解法相比，不需要提前把核桃蛋白提取出来，直接加菌种发酵即可得到核桃肽，但发酵时间过长，发酵设备体积较大，发酵过程中容易染菌等。因此两种方法各有优缺点，具体可看实际情况选择适宜的制备核桃肽的方法。

4.2 核桃肽功能性质的研究

马开创[29]对未脱皮热榨、未脱皮冷榨和脱皮冷榨三种原料处理方式制备的多肽进行功能特性比较研究。结果表明，脱皮冷榨制备的核桃多肽具有最佳的持水性、吸油性、乳化性、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性，同时具有最高的ACE抑制活性，抑制率达到63.04%。脱皮冷榨是最适宜的核桃原料处理方式，其制备的核桃多肽具有良好的ACE抑制功效。

4.3 核桃肽功能活性的研究

4.3.1 抗氧化活性

研究证实，人体内自由基在身体的整个系统中起着非常重要的作用，体内自由基过多会引发一系列疾病，如血管粥样硬化、糖尿病和高血压等[30]。近年来，研究发现核桃多肽具有很好的抗氧化活性，其抗氧化活性与其氨基酸序列有直接关系，金子纯研究发现，核桃清蛋白和醇溶蛋白对DPPH自由基具有明显的去除效果，消除率分别是97.15%和93.35%，核桃蛋白质组分的超氧阴离子清除率均高于抗氧化剂BHT的清除率，因此，选用适宜的酶水解蛋白可以得到抗氧化活性较强的活性肽[31-33]。刘昭明等[34]研究了3000 U以下的核桃蛋白肽混合物的抗氧化活性，实验结果指出，羟基自由基和超氧离子阴离子的清除能力与核桃蛋白肽浓度呈正相关关系，核桃蛋白肽浓度为30 mg/mL时的还原能力相当于Vc的57.1%，当浓度提高到50 mg/mL时，羟基自由基清除率达到69.1%，超氧阴离子的清除率更是达到了85%。核桃肽抗氧化活性的评价方法目前主要是体外化学试验，动物实验研究较少，体外化学试验主要测定项目有ABTS+·自由基的清除能力，羟自由基（·OH），清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·），超氧阴离子（O2－·）[35]及总抗氧化能力、Fe2+螯合能力、亚油酸过氧化能力等[36]。侯雅坤[37]选用了三种蛋白酶（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶）水解核桃蛋白，并通过优化酶解条件，在最佳的酶解条件下，研究发现胃蛋白酶酶解液的羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力是最强的。

4.3.2 核桃肽的降血压活性的研究

血管紧张素转化酶（ACE）在血压调节过程中发挥着关键性作用，而降压活性肽主要是通过抑制血管紧张素转化酶（ACE）的活性达到降压目的。降压活性肽的研究越来越受到研究者们的关注，其一般来源于食品，安全性高、作用温和，而且对正常人没有降压作用。目前对ACE抑制肽活性的检测方法主要是通过对原发性高血压大鼠注射ACE抑制肽，比较干预前后大鼠血压的变化来评价其活性大小。

顾欣等[38]从核桃蛋白酶解产物中分离纯化出了一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为Tyr-Glu-Pro，IC50值为0.32 ng/mL。许慧娇等[39]研究发现核桃粕水解液对ACE酶具有很好的抑制效果，IC50值为0.97～1.52 mg/mL。

此外近年来研究者们还陆续发现，核桃肽具有提高免疫活性[40]、抗疲劳活性[41]、改善学习记忆活性[42]、抗肿瘤活性[43]、调节体内代谢紊乱的活性[44]、抑菌活性[45]、醒酒活性[46]辐射防护[47]以及润肠通便[48]等活性。

由此可见，已发现核桃肽的功能活性越来越多，功能活性越来越得到人们的广泛关注和认可，相信还有更多核桃肽的未知活性有待于我们去探索和研究。目前对于核桃肽的研究还不够成熟，还不能广泛用于食品和保健品中，但核桃肽的研究具有非常深远的研究意义，相信核桃肽的未来一定有更加广阔的研究和发展空间。

5 结论与展望

近年来，核桃蛋白资源的开发和利用引起越来越多研究者们的广泛关注，因此核桃蛋白得到较为全面的开发和利用，但目前对核桃蛋白的分级提取和纯化及结构的研究不够深入和全面，核桃各类蛋白功能性质的系统研究和在食品上的应用也为数不多，尤其是占比高达70%以上的谷蛋白的利用尚未发现，因此为了更好地利用核桃蛋白这一优质资源，需要全面系统研究核桃蛋白的结构与功能的关系，进一步提高其在食品加工工业上的应用。

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Preparation, Characteristics and Research Progress of Walnut Protein

WANG Qinghua1,2, LU Min1a, XING Shisong1a, WANG Yaning1b, LI Xiceng1b

(1. a. Hebei Key Laboratory of Walnut Nutritional Function and Processing Technology; b. Hebei Technology Innovation Centre of Walnut Beverage, Hebei Yangyuan Zhihui Beverage Co., Ltd Hengshui, Hebei 053000, China;2. College of Life Science, Hengshui University, Hengshui, Hebei 053000, China)

The development and utilization, separation and extraction, structure and characteristics of walnut protein are discussed. The research and development of walnut peptides with walnut protein as raw material, including their preparation method and the functional activity of walnut peptide, were mainly analyzed.

walnut protein; walnut peptide; functional activity

10.3969/j.issn.1673-2065.2022.01.006

王青华（1978—），女，河北衡水人，讲师；

路 敏（1985—），男，山西晋城人，高级工程师。

河北省科技计划项目（20327108D）；河北省高层次人才项目（B2020003035）；河北省创新能力提升计划后补助项目（199A7123H）

TS255.6

A

1673-2065(2022)01-0022-07

2021-06-13

（责任编校：马惠钦 英文校对：李玉玲）