脾虚肝亢证抽动障碍动物模型制备研究与应用现状

史文丽 陈慧敏 马丙祥

(1 河南中医药大学，郑州，450000； 2 河南中医药大学第一附属医院，郑州，450000)

抽动障碍(Tic Disorder，TD)是一种复杂的儿童常见的神经发育障碍性疾病[1-2]，临床表现为突然、快速、反复、非节律性的运动或发声[3-4]，属于中医学“肝风证”“慢惊风”“抽搐”“筋惕肉瞤”等范畴，90%可伴注意力缺陷多动障碍、强迫障碍、自闭、焦虑、品行障碍、人格障碍及睡眠障碍等共患病[5-6]。目前全球发病率逐步上升[7]，国内发病率为1%～4%，全球发病率约3%，对学习、生活、社交均造成危害[8-10]。

动物模型是挑战和验证病理生理学假说的重要工具，并且在验证新的治疗方案中扮演重要角色。目前，国内医学界对TD及其动物模型的认知程度非常有限，尤其是基于病证结合的动物模型。中医临床强调的是整体观和辨证观，最新的中药新药临床试验设计与评价技术指南将本病分为肝亢风动、痰火扰神、气郁化火、脾虚痰聚、脾虚肝亢、阴虚风动6个证候，其中脾虚肝亢证最常见。因此，进行更精确的脾虚肝亢证TD动物模型相关研究有利于病因、病机探索及加速新药研发进程。

1 脾虚肝亢证渊源

宋代闫孝忠(一说闫季忠)所著《小儿药证直诀》卷上五脏所主有云：“心主惊，肝主风，脾主困，肺主喘，肾主虚。”[11]虽然强调了五脏分证，但同时需要重视五脏之间的相互影响[12-14]，故临床采用“五脏证治理论”辨证治疗TD[15-16]。由于小儿“肝常有余、脾常不足”体质特点，故脾虚肝亢证最为多见。小儿脾常不足，饮食失节，恣嗜寒凉，常吃零食，或患病用药，损伤脾气，脾虚木乘，肝风内动，加之脾失运化水湿，终致风痰内扰[17]。基于上述，并结合儿科宗师钱乙的“五脏证治理论”解析TD，认为该病与体质相关，病位责之于五脏，主要在肝，与脾关系密切，初步总结出“脾虚肝亢、风痰内扰”是TD的主要病机，可从肝脾论治，这与当代很多医家学术思想一致，并且符合“五脏有余不足论”[18-22]。

2 病证结合动物模型的建立

既往动物模型多局限于“病”的复制，故不能观察中医证候演变，亦无法体现中医的辨证论治。现代医学之“病”结合中医之“证”建立的病证结合动物模型，有利于探索疾病及其演变过程与证候之间的关联性，并将动物研究更贴近人类疾病的临床诊治，是当前动物模型研究中较为理想的造模方法，并随着部分病证结合动物模型的日趋成熟，填补了“一证一个体”基础研究的空白[23-24]。

2.1 实验动物的选择 考虑到抽动表型的高度复杂性，动物方面通常采用哺乳动物，包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猫和猴子，其中以啮齿类动物小鼠、大鼠为主，主要是基于它们具有很高的成本效益和与人类神经生物学高度相似性[25]。基于人群和双胞胎家庭的研究验证了TD的遗传学基础，随着二代测序及全基因组的广泛应用，推翻了TD符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病假说，不仅增加了大量候选基因，而且制备了基因突变及基因敲除动物模型[26-27]。故基因变异动物已逐步扩展应用，但多出现在国外的基础研究中。

2.2 TD“病”模型的制备 目前国内外的TD动物模型大致分为基因、环境因素暴露及药理学3大类，其中基因模型和环境因素暴露模型是国际研究热点，前者因更能明确造模目的及药物作用靶点、符合模型评价的结构有效性和预测有效性，故应有最多，主要包括SLC6A3、MAOA、CNTNAP2、SLITRK、HDC、NLGN、SAPAP3和D1CT-7等基因模型[28]，但缺点是表面有效性不能完全符合且价格昂贵。环境因素暴露模型(多发生于孕期和围产期)主要包括早期应激和产科因素模型、早期神经炎症模型，在发病因素研究中应用最多。目前国内基础研究使用最多的是药物模型，主要使用苯丙胺(Amphetamine，AMP)、阿扑吗啡(Apomorphine，APO)、2，5-二甲氧4-碘苯-2-氨基丙烷(2,5-dimethoxy 4-iodobenzene-2-aminopropane，DOI)、亚氨基二丙腈(Imino Dipropionitrile，IDPN)、6-羟基多巴胺氢溴酸盐(6-Hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA)、谷氨酸等实现模型制备，具体如何操作不再赘述，在中医药实验研究中IDPN模型应用最多。但是，上述三大类TD动物模型并没有和中医的“证”相结合，只是进行“病”的模型制备。

2.3 脾虚肝亢证的“证”模型的制备 李继君等[23]制备脾虚肝亢证TD动物模型方法：采用血清微量灌注技术，将该证候患者未稀释血清微量灌注于Wistar大鼠脑内，1例血清仅用于1只大鼠。该方法从刻板动作进行了主症的表面有效性分析，宁动颗粒干预后TD大鼠刻板动作减少,从主症的角度预测模型有效性。宁动颗粒以钩藤、天麻、党参、麦冬为君，以龙骨、牡蛎为臣，以白芍、甘草为佐使之药，从柔肝平肝角度进行肝亢的有效性预测，尚缺乏脾虚症状及其评估。陈自佳[24]制备小鼠模型方法：腹腔注射IDPN 350 mg/(kg·d)诱导当日，结合浓度为1 g/mL的番泻叶颗粒剂溶液20 mL/(kg·d)、50 mL/(kg·d)及大黄颗粒剂溶液50 mL/(kg·d)灌胃，连续8 d，最终发现大黄组表面有效性及结构有效性最佳。在主症方面从自主活动和刻板动作进行分析，兼症从食欲不振(食量减少)、消瘦(体质量下降)、大便溏泄(排便次数增多，便形溏稀，肛门污秽)、倦怠乏力(悬空拉尾抵抗力减弱)、毛发不荣、拱背、萎靡嗜睡进行脾虚症状评估，从胸腺及脾脏指数、胃泌素、D-木糖等指标进行病理学评估。通过健脾止动汤进行有效性预测评估，方中太子参、茯苓、甘草益气健脾，陈皮理气健脾、和中化滞，半夏辛温燥湿化痰、辛行苦泄，川芎、防风等清肝泻火。刘晓芳等[29]制备大鼠模型方法：腹腔注射IDPN 300 mg/(kg·d)诱导当日，结合饮食失节、慢性束缚以及过度疲劳。该方法在主症方面从自主活动和刻板动作进行分析，在兼症方面，从神疲气短、少气懒言、食少便溏等进行脾虚证的验证。在有效性预测方面通过自拟方干预后自主动作和刻板动作减少，方中四逆散加减以透邪解郁、调和肝脾，升降散加减以宣发郁热、调畅气机，乌梅丸加减以调和阴阳、柔肝息风，从疏肝平肝达“总以调畅气机为要”，并通过血清中脑源性神经营养因子进行结构有效性及有效性预测评估。TD基本病机为肝风内动，和肝亢关系密切。如上所述，这3种方法均对主症表面有效性进行评估，并进行了有效性预测评估，后2种方法进一步评估了结构有效性，并从脾虚方面评估其表面有效性，但肝亢症状验证不足。整体上，第2种方法最为全面地从“证”的模型构建进行评估，选用方剂以四君子汤为主，从健脾入手进而扶土抑木、化痰熄风，最贴切其脾虚肝亢、风痰内扰证的发病机制。

3 病证结合动物模型的评价体系

3.1 宏观表征 根据中医辨证思维，中华中医药学会儿科分会临床评价学组发布的《儿童抽动障碍中药新药临床试验设计与评价技术指南》将脾虚肝亢证TD定义为：主症：1)腹部抽动明显；2)手脚多动，难于静坐；3)注意力不集中。兼症：1)性情急躁；2)烦躁易怒；3)睡眠不安；4)多梦；5)目赤；6)口苦；7)叹息；8)胁胀；9)健忘；10)食欲不振；11)便溏。舌脉：舌淡红，苔薄白；脉细弦。具备主症1)，兼症6项，参考舌脉即可辨证[30]。“有诸内者，必形诸外”，该评价方法以中医基础理论为根本，通过四诊合参信息反映中医病证本质。目前研究多通过行为学测定、自主活动仪检测、刻板运动观察评分这3个方面进行主症评价，满足模型表面有效性评估[24]。脾虚兼症通过模型动物的活动活跃度、形态变化、毛色顺滑度及体表被毛性、饮食量、排便次数及腹形大小等判定[24]，但部分兼症(尤其是肝亢症状)以及舌脉无法评定。由上可见，病证结合动物模型虽能够最大限度模拟，但因为病证复杂、不断演变、个体差异以及症状和体征主观判断性强等特点，量化指标统计分析方面存在难度。从上述3种病证结合动物模型看，已经实现了主症(如腹部抽动、手脚多动)及脾虚症状(食欲不振、便溏)的模拟，但肝亢症状(性情急躁、烦躁易怒、目赤、口苦等)目前暂未实现，提示了下一步研究方向。由此说明病证结合动物模型的评价体系尚未成熟，需要进一步完善。

3.2 微观指标

在实际工作中无法将病证结合动物模型的宏观表征等同于中医特定的临床证候，在实验中研究者多结合病理生理学基础，满足模型结构有效性及预测有效性评估，体现将临床证候相关的理化指标融入微观层面的诊治指标。笔者结合模型鉴定的3个要素把微观指标分为3大部分，其中中枢神经病理生理学、理化指标用于“病”模型鉴定，非中枢神经指标用于“证”模型鉴定，这也体现了中医基础理论的整体观，其中脾虚证的评估较为成熟，可供今后参考[24，29]，但肝亢证的微观指标尚未在本病中报道。

3.2.1 通过中枢神经病理生理学变化进行“病”模型评价 病理生理学改变最能体现模型评价中的结构有效性，是模型鉴定的重要部分，多项研究通过苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色方法已验证TD模型动物的神经病理改变，主要观察海马CA2区、门区及齿状回神经元结构及数目是否出现改变。海马CA2区锥体细胞排列紊乱，数量减少，部分细胞出现空泡变性，大量细胞出现核固缩坏死，门区锥体细胞排列紊乱，大量神经元细胞肿胀、核固缩坏死，由典型的多角形变为三角形或不规则形，周边胶质细胞浸润，顶树突明显减少，排列混乱；齿状回神经元坏死，大部分颗粒细胞浓缩、深染，细胞数量明显减少，排列疏松[31]。

3.2.2 通过中枢神经理化指标变化进行“病”模型评价

3.2.2.1 多巴胺 多巴胺(Dopamine，DA)是由中脑为主的多个脑区的神经元产生，主要是黑质致密部(Substantia Nigra Pars Compacta，SNc)和腹侧被盖区(Ventral Tegmental Area，VTA)，并能投射支配许多大脑区域，包括纹状体和其他基底神经节核、不同的额叶皮质区和部分边缘系统。主要的DA能神经通路是黑质纹状体通路(SNc→背纹状体)、中间边缘通路(VTA→伏隔核)和中间皮质通路(VTA→额叶皮质)。多个实验研究已证实IDPN可干扰DA在机体内代谢，故使用此方法制备的TD模型组动物表现为DA及其多巴胺1型受体(DA Receptor Type 1，D1R)代谢产物高香草酸(Homovanillic Acid，HVA)升高，D2R、多巴胺转运蛋白(Dopamine Transporter，DAT)、儿茶酚-O-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)降低，静安口服液、菖蒲郁金汤、祛风止动方等可调控D2R、DAT、COMT进而下调DA表达以及HVA含量[32-34]。

3.2.2.2 5-羟色胺 5-羟色胺能神经元(Serotoninergic Neuron，SN)是以5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)为递质的神经元，主要集中于脑干的中缝核，并投射到纹状体、黑质及皮层，支配神经系统的所有区域。既往研究表明TD患者血浆色氨酸水平明显降低，推测与5-HT代谢酶合成过多或诱导性过高有关，进而推论TD与5-HT代谢紊乱有关，并且下游产物5-羟吲哚乙酸也可反映5-HT的代谢水平。DOI是选择性5-HT(2A/2C)受体激动剂，故多采用DOI模型观察5-HT含量变化，而中药干预可起到上调作用[32]。5-HT在脑的高级部位和多种神经活动方面起着普遍的抑制和稳定作用，故在TD合并强迫症的研究中应用最多，并有学者正在研究该指标与睡眠障碍之间的关联性。

3.2.2.3 去甲肾上腺素 产生去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)的神经元位于脑干，投射广泛，支配所有中枢神经系统区域。实验证明IDPN模型组大鼠脑组织及血浆的NE水平较正常对照组显著升高，菖蒲郁金汤能一定程度上降低NE能神经元兴奋性，通过抑制NE表达从而达到抗抽动效应[33]。DA是合成NE的前体，影响DA代谢的药物也可能影响NE的水平，产生NE的神经纤维与产生DA、乙酰胆碱和5-HT的神经元相互连接。因此，自然发生的改变和药理学诱导的NE信号变化都可能导致其他调节途径的复杂改变，而NE水平的降低可抑制行为、提高注意力及记忆力。

3.2.2.4 氨基酸类神经递质 氨基酸类神经递质改变作为TD的病理生理学基础，因与中医的阴阳平衡理论相似是近年研究的热点之一。氨基酸本身作为一种神经递质及多种神经递质的前体物质和中间产物，参与神经系统的营养发育及信息的传递、整合。既往研究已证实，TD模型动物脑组织及血样中兴奋性氨基酸谷氨酸(Glutamic Acid，GLU)、谷氨酸转运蛋白(Glutamate Transporter 1,GLT1)、兴奋性氨基酸转运体(Excitatory Amino Acid Transporter2,EAAT2)升高，抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric Acid，GABA)降低[35]，而健脾止动汤可下调GLU[36]和EAAT2[37]，进一步阐述通过调节阴阳可抑制神经兴奋性，因此以氨基酸类神经递质作为靶点的研究广泛用于TD及注意力缺陷多动障碍的基础研究及新药制药领域。

目前采用药理学模型观察理化指标变化在国内应用较多，同样也是药物机制研究的热点模型。在基础研究中学者多采集纹状体、皮质、脑脊液的透析液、血液作为标本进行神经递质指标检测，在方法上神经递质采用高效液相色谱法和(或)酶联免疫吸附试验法，而受体、转运体等关键蛋白采用蛋白质印迹法、荧光定量PCR等方法，亦有采用MicroPET技术检测DAT报道。除此之外，基于强啡肽[38]、下丘脑-垂体-肾上腺轴[39-40]、下丘脑-垂体-性腺轴进行的动物实验较少，但后二者在临床研究中应用较多。目前通过上述病理基础对TD疾病模型的有效性评估较为成熟[41]，但用于脾虚肝亢证TD病证模型方面较少[42]。不同证型差异性研究暂空白，今后可将中枢神经病理生理学和神经理化指标用于疾病模型评价。

3.2.3 通过非中枢神经指标变化进行“证”模型评价

3.2.3.1 脾脏和胸腺指数测定 脾脏和胸腺是2大免疫器官，前者为中枢细胞免疫，后者为外围免疫器官，二者结构变化及功能高低直接影响机体免疫水平，多位学者认为这2项指数可作为判断脾虚相关证候的病理指标。陈自佳[24]和刘晓芳等[29]的实验表明中医证型组和模型组动物脾脏和胸腺指数较空白组下降，再次验证二者的直接关联性。

3.2.3.2 胃泌素和D-木糖浓度测定 胃泌素(Gastrin，GAs)又称促胃液素，直接参与消化道结构与功能的发育和成熟，是反映胃蠕动及胃动力学的关键指标，因能促进胃排空和激发胃窦平滑肌收缩反应，被认为是脾虚肝亢证的病理基础，另有用于脾虚肝郁证的报道[29]。D-木糖能客观体现消化吸收功能，从中医角度上讲，脾主运化水谷，并将精微物质散布至五脏六腑及四肢末节，正与上述的消化吸收相吻合，故D-木糖被认为是与小肠吸收功能和脾虚证呈正相关的敏感和特异指标，并在基础研究中得到证实[24]。

4 小结与讨论

在TD模型的3种制备方法中，药理学模型因最能体现表面有效性、结构有效性、预测有效性的3种评价，在国内最为肯定且使用最多，故以此为背景浅谈脾虚肝亢证TD病证结合动物模型的相关研究。目前国内外已经能根据药理学模型进行不同神经递质变化的研究，如观察药物是否通过调控DA起到治疗作用时需选用IDPN模型，而关于5-HT的机制研究需选用DOI模型，但尚未有能将每种神经递质对应其自身的药理学模型。另一不足之处是药理学模型与中医的“证”尚未建立对应关系，在“病”模型制备的同时需要“证”的构建。在“证”构建方面，脾虚证的构建和评价方法很多，但关于脾虚肝亢证的较少，严格意义上讲，用于TD的仅有2个，文献中涉及的通过大黄、大承气汤、饮食偏嗜、劳倦及利血平等方法制备的脾虚证模型是否能用或者如何用于脾虚肝亢证TD模型制备尚不可知[43]，如何根据基因模型进行病证结合动物模型制备也有待于进一步探讨[44]。模型评价是基础研究的重要部分，既往研究已表明，在宏观表征方面研究者能分别通过“病”和“证”对脾虚肝亢证TD进行简单模型评价；在微观指标方面，中枢神经病理生理学改变在多项基础研究中得到证实，有助于结构有效性评价。用于临床的理化指标在动物体内不能一一被复制，但已经在动物实验中验证的中枢神经递质可基本满足“病”模型的评价，其中IDPN/DA和DOI/5-HT的关联性是需要注意的，并且IDPN干预后的实验鼠体质量降低提示IDPN模型本身具有体质量下降这一体现脾虚证的特征，更适合脾虚肝亢证TD疾病模型制备[24]。脾脏和胸腺指数测定、胃泌素和D-木糖浓度测定目前已被验证可确切用于脾虚肝亢证TD基础研究中，但伴随脾虚肝亢这一“证”构建的日益成熟，后续会不断出现评价“证”的宏观表征和微观指标。

TD动物模型的研究可提高医学者对本病的认识和研究水平，成为探索神经精神系统与TD发病联系的关键点。中医病证结合的动物模型可弥补西医“病”模型和单因素的中医病因病机“证”模型的不足，且更具说服力，是临床诊断治疗及新药研发的基础[45]。通过脾虚肝亢证TD病证结合动物模型的文献回顾性分析发现，对于“证”的构建、评价和如何将“病”和“证”更好地结合仍存在局限性。同时为了使实验研究更贴近临床疗效，怎样建立“证”的量化评价体系，进一步提高中医药建设的现代化和科学化，是我们要继续努力的方向。