POLQ对SACC-83细胞的影响及POLQ基因表达调控因子预测

白晗 刘涵 朱蕾 刘超 李楠 肖晶

唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma， SACC)具有高复发及转移倾向的特点，患者远期生存率低，无有效治疗措施[1-3]。因此，阐明SACC发生发展的生物学分子机制，对于优化SACC治疗策略具有重要意义。

POLQ(polymerase theta)基因高表达于特定的正常组织及多种肿瘤组织中，主要参与alt-NHEJ(alternative non-homologous end joining)修复通路[4-6]。本课题组前期研究发现PTEN(homologue deleted on chromosome 10)低表达的SACC中POLQ高表达，POLQ与SACC恶性程度及较差的预后正相关，且PTEN与POLQ无直接相互作用，表明POLQ是受PTEN间接调控的促癌因子，但调控机制尚不明确。

本研究分析了POLQ在肿瘤及正常组织中的差异表达，探讨了POLQ作为SACC治疗靶点的可能性，并初步探究POLQ异常高表达的调控机制，提出治疗SACC的新靶点。

1 材料与方法

1.1 基因表达分析

利用TIMER2.0数据库(http://timer.comp-genomics.org/)，评估肿瘤样本和同位正常组织中POLQ表达量的差异。

1.2 细胞培养

SACC-83细胞系应用含10%胎牛血清(Gibco，10099-141, 美国)及1%双抗(Gibco，15140122)的1640培养基(Gibco，C11875500BT)于恒温37 ℃、 5% CO2、相对湿度95%以上的无菌培养箱中培养， 每48 h换液一次。

1.3 细胞转染

细胞接种于6 孔板贴壁后按照Lipofectamine®3000(Invitrogen，L3000015，美国)说明书配制并加入转染试剂，6 h后换液。shRNA及siRNA由上海吉玛公司合成，序列为：对照组shControl(5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′)、POLQ干扰组shPOLQ(5′-CACCGGATATATTTCCTGTCCAAGATTCAAGAGATCTTGGACAGGAAATATATCCTTTTTTG-3′)、PTEN干扰组siPTEN(5′-GAUCUUGACAAAGCAAAUATT-3′)以及对照组siControl(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。

1.4 CCK-8细胞增殖实验

转染24 h的细胞消化后接种于96 孔板， 5 000 个/孔，培养1～6 d后，弃培养基，加入CCK-8(北京全式金生物，FC101)10 μL和含10% FBS的培养基100 μL，培养2 h，检测450 nm的吸光度值。

1.5 平板克隆实验

转染24 h后常规消化，以5 000 个/孔接种于6 孔板常规培养，直至肉眼可见克隆后，弃培养基，用预冷无水乙醇4 ℃固定30 min，洗涤后用0.1%结晶紫(索莱宝，G1063)静置染色30 min，双蒸水清洗至细胞克隆清晰可见后，拍照呈像。

1.6 qRT-PCR

转染72 h后收集细胞，用Trizol法(Takara，9109，日本)提取细胞总RNA，反转录(Takara，RR047A)，并扩增(Takara，RR820A)所得cDNA(95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 循环40 次)。引物由Takara公司合成，序列见表 1。

表 1 qRT-PCR引物序列

1.7 启动子及转录因子预测

应用Cistrome数据库(http://dbtoolkit.cistrome.org/)预测与POLQ启动子结合的转录因子，AnimalTFDB3.0数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/)预测转录因子的特异性结合位点，TIMER2.0数据库(http://timer.comp-genomics.org/)分析蛋白表达相关性。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 POLQ在肿瘤中的表达

TIMER2.0分析结果显示，与正常组织相比，POLQ在包括头颈部肿瘤(head and neck squamous cell carcinoma, HNSC，P=6.25e-19)在内的19 种肿瘤中呈较高水平表达，仅在部分乳腺浸润癌(breast invasive carcinoma, BRCA)肿瘤亚型中无明显变化及在皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma, SKCM)中下调，提示POLQ高表达是促进大多数肿瘤发生发展的重要因素(图 1)。

图 1 TIMER2.0分析肿瘤与正常组织之间的POLQ差异表达

2.2 POLQ干扰对SACC-83细胞增殖及克隆形成能力的影响

本课题通过研究靶向抑制POLQ对SACC-83细胞的影响，探讨POLQ作为治疗SACC新靶点的可能性。CCK-8细胞增殖实验结果显示，与对照组SACC-83细胞相比，POLQ干扰组SACC-83细胞增殖能力被抑制。两组细胞生长曲线随培养时间延长而呈现逐渐上升的趋势，但与对照组相比，POLQ干扰组的生长曲线上升相对平缓(图2A)。平板克隆实验结果显示，对照组及POLQ干扰组克隆形成数目分别为133.33±27.78及48.00±9.80个。与对照组相比，POLQ干扰组形成的克隆数目降低(图 2B)。

图 2 CCK-8细胞增殖实验及平板克隆实验检测POLQ干扰对SACC-83细胞增殖(A)及克隆形成能力(B)的影响

2.3 生物信息学预测结合POLQ启动子的转录因子及 FOXM1靶向结合位点预测

用Cistrome数据库Toolkit模块预测出的可能性最大的前20 个转录因子中(http://dbtoolkit.cistrome.org/?specie=hg38&factor=tf&interval=Chr3%3A121545889-121547988#plot_result)，仅FOXM1(forkhead box M1)既受PTEN负调控，又与DNA修复相关，且POLQ基因启动子上有5 个FOXM1结合位点(图 3A)。用AnimalTFDB3.0预测出FOXM1在靶基因启动子上的特异性结合位点长度为13 bp，特异性结合序列为A/G-A/T-A/C/G-A/C-A/T-C/T/G-A/G-A/C/G-A/T-C-A/T/C-A/C/-C/A(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/tf_gene_info?tf=ENSG00000111206)(图 3B)。

图 3 Cistrome预测结合POLQ启动子的转录因子(A)及AnimalTFDB3.0预测FOXM1的特异性结合位点(B)

2.4 FOXM1与POLQ在肿瘤中的表达相关性分析

TIMER2.0分析结果显示，在包括HNSC在内的39 种肿瘤中FOXM1与POLQ表达水平正相关，仅在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UVM)中二者表达水平无相关关系(图 4)。

图 4 TIMER2.0分析肿瘤中FOXM1与POLQ的表达相关性

2.5 PTEN干扰的SACC-83细胞中POLQ与FOXM1的表达

qRT-PCR结果显示，与对照组相比，PTEN干扰组细胞POLQ与FOXM1基因mRNA的表达上调(图 5)。

图 5 qRT-PCR实验检测PTEN干扰对SACC-83细胞POLQ与FOXM1表达水平的影响

3 讨 论

POLQ基因广泛表达于正常组织及肿瘤组织中， 促进alt-NHEJ通路中退火产物的延伸[7]。alt-NHEJ修复中，PARP1(poly(ADP-ribose)polymerase 1)先与DNA断端结合，POLQ插入核苷酸延伸退火产物。数据库分析显示，POLQ在多种肿瘤中表达高于正常组织，提示POLQ高表达是促进绝大多数肿瘤发生发展的重要因素。本课题组前期研究发现POLQ与SACC恶性程度及较差的预后正相关，表明POLQ促进SACC发生发展。本研究证实，POLQ表达降低抑制SACC-83细胞增殖及克隆形成能力。本研究还发现POLQ表达降低促进γH2AX(phospho-histone H2A.X)、ATM(ataxia telangiectasia mutated)以及ATR(ataxia telangiectasia and Rad3 related)表达，并抑制PARP1表达，表明POLQ下调促进DNA双链断裂、激活DNA损伤应答、抑制alt-NHEJ通路，目前相关结果正在投稿中。以上结果提示POLQ作为SACC治疗靶点的可能性。

SACC中PTEN负调控POLQ，且PTEN与POLQ无直接结合，说明有中间因子介导PTEN调控POLQ。DNA聚合酶多由转录因子调控，推测POLQ也可能受转录因子调节[8-10]。POLQ与DNA修复有关，于是应用Cistrome预测出与POLQ启动子结合的DNA修复相关转录因子FOXM1。FOXM1促进肿瘤发生发展，缺失时可导致非整倍体及DNA断裂数量的增加，表明FOXM1参与维持基因组稳定性和DNA修复[11-13]。此外，FOXM1受PTEN负调控，并与PI3K/AKT通路正相关[14]。数据库显示FOXM1与POLQ在多种肿瘤中表达正相关，且下调PTEN促进SACC-83细胞FOXM1与POLQ表达上调，提示二者可能存在直接调控关系。在未来研究中，可通过双荧光素酶报告基因实验明确FOXM1与POLQ的直接调控关系及结合位点。

总之，本课题研究了POLQ对SACC-83细胞的影响，分析了POLQ与FOXM1在多种肿瘤中的表达相关性，首次提出PTEN/FOXM1/POLQ通路存在的可能性，以及FOXM1可能是SACC治疗新靶标。