香水莲花花蕊醇提物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用及其主要成分

张 静， 侯北伟， 尹峥桢， 姜洪芳， 姚正颖， 孙力军， 张俊杰，①

(1. 江苏海洋大学食品科学与工程学院， 江苏 连云港 222005； 2. 南京野生植物综合利用研究所， 江苏 南京 211100)

痛风是一种由尿酸盐沉积引起的、与晶体相关的关节病。大量研究结果[1-3]表明：药用植物的醇提物、水提物以及乙酸乙酯提取物等对黄嘌呤氧化酶(XOD)具有较高的抑制率，其中黄酮类、酚酸类和生物碱类等活性成分均对XOD有抑制作用，具有较强的降尿酸功能。

香水莲花(Nymphaeasp.)为水生宿根草本植物，具有降血脂、抗氧化和抗衰老等功能[4-6]。香水莲花富含黄酮、多糖和多酚类等活性成分，其花蕊水提物对XOD有抑制作用[7]，但其醇提物对XOD的抑制作用尚不明确。为此，作者以香水莲花花蕊为研究材料，研究其醇提物对XOD的抑制作用，并采用液质联用法确定其醇提物的主要成分，为可调节尿酸水平的功能性食品开发提供基础研究数据。

1 材料和方法

1.1 材料

紫色香水莲花的干燥花朵于2019年购于安徽芜湖，由南京野生植物综合利用研究所张卫明研究员鉴定。取雄蕊和雌蕊，用粉碎机粉碎后过80目筛，密封保存、备用。

甲酸(色谱级)、甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)、黄嘌呤(X7375-10G)和黄嘌呤氧化酶(X1875-5UN)购于美国Sigma公司；阳性对照品别嘌醇片购于合肥久联制药有限公司；没食子酸、鞣花酸和槲皮苷标准品(纯度≥98%)均购于瑞士Adamas公司；其他试剂均为分析纯，购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醇提物制备 称取15 g样品粉末，按料液比1∶10(m∶V)加入体积分数70%的乙醇，浸提24 h后于60 ℃、40 kHz条件下超声提取45 min，常温下4 000 r·min-1离心15 min，滤渣重复提取1次；合并上清液，于50 ℃旋转蒸发至膏状，冷冻干燥后研磨，备用。

1.2.2 XOD抑制活性测定 XOD抑制活性的测定参照文献[7，8]的方法并加以改进。醇提物、别嘌醇片和3个标准品(没食子酸、鞣花酸和槲皮苷)均用二甲亚砜(DMSO)溶解，配制成不同质量浓度的样品，其中醇提物的质量浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25和2.50 mg·mL-1；别嘌醇质量浓度分别为1.0、2.0和3.0 μg·mL-1；3个标准品的质量浓度分别为0.5、1.0和2.0 mg·mL-1，均设置3个平行组。酶促反应体系包括待测样品200 μL(空白组为DMSO 200 μL)、1.5 mmol·L-1黄嘌呤溶液100 μL、5 U·mL-1XOD溶液3 μL，用磷酸盐缓冲液(pH 7.5)补充至10 mL；混匀后在室温条件下于波长295 nm处测定吸光度，参照文献[7]的方法计算不同质量浓度醇提物以及阳性对照和标准品对XOD的抑制率；并以供试样品的质量浓度为自变量x、抑制率为因变量y拟合回归方程，根据回归方程计算供试样品的半数抑制浓度(IC50)。

在上述酶促反应体系中固定XOD浓度不变，分别加入0.375、0.750、1.500和3.000 mmol·L-1黄嘌呤溶液以及0.00、1.75、2.00和2.25 mg·mL-1醇提物，按照上述方法测定吸光度，以反应时间为横坐标、吸光值为纵坐标作图，并根据直线斜率计算反应速率；采用双倒数作图法，以黄嘌呤溶液质量浓度的倒数为横坐标、反应速率的倒数为纵坐标作图，评价醇提物对XOD的抑制作用类型，并据此计算抑制动力学常数(Ki)。

1.2.3 醇提物主要成分分析 冷冻干燥后的醇提物和标准品没食子酸、鞣花酸和槲皮苷用乙腈溶解并配制成1 mg·mL-1待测样品，用0.4 μm有机系微孔滤膜过滤后备用。

采用Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)进行HPLC分析。色谱柱为Eclipse XDB-C18分离柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司)。以体积分数0.1%甲酸-水溶液(流动相A)和乙腈(流动相B)进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～10 min，5%～13%B；10～15 min，13%～18%B；15～30 min，18%～23%B；30～40 min，23%～28%B；40～45 min，28%～33%B；45～50 min，33%～40%B；50～55 min，40%～100%B。流速0.8 mL·min-1；柱温35 ℃；进样量20 μL；醇提物检测波长为260和360 nm，标准品检测波长为360 nm。

采用Agilent 1290 Infinity LC/6460 QQQ MS液相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)进行质谱分析。质谱条件： ESI离子源，喷雾电压4 kV，雾化气体N2，雾化压力344.75 kPa，雾化气流速10 L·min-1；碰撞气体为He，碰撞电压250 V，干燥温度350 ℃；扫描方式为负离子，离子范围m/z100～2 000；采用Qualitative DA Software B.08.00工作站对数据进行分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，应用回归分析法计算IC50及Ki值；采用Origin 6.0软件作图。

2 结果和分析

2.1 香水莲花花蕊醇提物对XOD的抑制活性

不同质量浓度香水莲花花蕊醇提物对XOD的抑制率见图1；对XOD的抑制动力学分析结果见图2。

由图1可见：香水莲花花蕊醇提物对XOD的抑制率随其质量浓度升高而增大，总体上差异显著(P<0.05)。质量浓度为0.50～1.25 mg·mL-1时，抑制率随着质量浓度的升高快速增大；质量浓度为1.25～1.50 mg·mL-1时，抑制率增幅减小；质量浓度为1.50～2.50 mg·mL-1时，抑制率增幅再次增大。此外，香水莲花花蕊醇提物对XOD抑制作用的半数抑制浓度(IC50)为38.54 μg·mL-1(拟合方程y=3.91x+1.11，r2=0.994)，明显大于阳性对照别嘌醇片的IC50值(0.015 μg·mL-1)。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

： 0.00 mg·mL-1； ： 1.75 mg·mL-1； ： 2.00 mg·mL-1； ： 2.25 mg·mL-1.

由图2可见：随香水莲花花蕊醇提物质量浓度的提高，直线斜率和在纵轴上的截距均相应增加，且图中4条直线均相交于第2象限，说明香水莲花醇提物对XOD抑制类型为混合型抑制，且该抑制反应的动力学常数(Ki)为0.95 mg·mL-1。

2.2 香水莲花花蕊醇提物的主要组成成分

液相色谱和质谱分析结果表明：香水莲花花蕊醇提物的主要成分为没食子酸、鞣花酸和槲皮苷，且没食子酸的吸收峰为主要峰。对这3种化合物进行XOD抑制活性检测，结果显示：没食子酸和槲皮苷对XOD均无明显的抑制作用，而鞣花酸对XOD有较强的抑制作用，IC50值为7.56 μg·mL-1(拟合方程y=4.31x+6.81，r2=0.987)。

3 讨论和结论

前期研究表明：香水莲花花蕊水提物对XOD有抑制作用，抑制类型为竞争性抑制，半数抑制浓度(IC50)为145.80 μg·mL-1[7]。本研究结果表明：香水莲花花蕊醇提物对XOD也有抑制作用，但抑制类型为混合型抑制，IC50值仅为38.54 μg·mL-1，说明同种植物的不同溶剂提取物对XOD的抑制类型存在差异。

研究结果表明：香水莲花花蕊醇提物的主要成分为没食子酸、鞣花酸和槲皮苷，其中鞣花酸对XOD的IC50值为7.56 μg·mL-1，没食子酸和槲皮苷对XOD无抑制作用。桉(EucalyptusrobustaSmith)叶提取物中鞣花酸对XOD的IC50值为22.51 μg·mL-1[9]，与本研究结果存在差异，这可能与反应体系及仪器设备造成的客观误差有关，但2个研究均证实鞣花酸对XOD具有一定的抑制作用。没食子酸对XOD的抑制作用为特殊的混合型抑制，但抑制效果较弱，而VC可协同提高没食子酸对XOD的抑制率[10]；鞣花酸对XOD的抑制作用为竞争性抑制[9]，而香水莲花花蕊醇提物对XOD的抑制作用为混合型抑制，说明该醇提物中除了鞣花酸，没食子酸及其他成分也对XOD的抑制作用有协同影响。且在香水莲花花蕊醇提物中，没食子酸的吸收峰为主要峰，因此，该醇提物中没食子酸及其他成分对XOD的抑制作用有待进一步研究。

综上所述，香水莲花花蕊醇提物对XOD具有一定的抑制作用，且抑制率随其质量浓度升高而增大，抑制作用类型为混合型抑制；该醇提物中的主要成分为没食子酸、鞣花酸和槲皮苷，其中鞣花酸对XOD具有一定的抑制作用，但醇提物中各成分之间的协同作用有待进一步研究。