基于“味性化味-网络药理-分子对接”的藏药四味姜黄汤防治糖尿病肾病的作用机制预测

仁增加， 李啟恩,2*， 切羊让忠， 彭毛东主,3， 贡却坚赞,2*

(1.青海大学藏医学院，青海 西宁 810000；2.藏药新药开发国家重点实验室，青海 西宁 810016；3.青海省藏医院，青海 西宁 810016)

糖尿病肾病是糖尿病血糖控制不良引起的一种最常见的微血管并发症, 也是糖尿病患者的主要致死原因[1]。目前在中国已有9 200万糖尿病患者, 1.48亿糖尿病前期患者[2]，糖尿病肾病的患病率也随糖尿病患者的增加而提高，故早期对糖尿病肾病进行防治极为重要。藏医认为糖尿病肾病属于“京尼萨库”病的范畴，始载于八世纪的藏医药经典著作《四部医典》，是由于偏摄咸、酸和甘味及性寒、重的饮食及久居湿寒之地，致使藏医“三因”中的“培根”偏盛和七精之“脂肪”过剩，导致精华不化而随糟粕经肾脏和膀胱排出体外，致使主司消化和吸收的藏医“三火”衰弱而引发肾脏受损的一种疾病。

藏药四味姜黄汤是藏医治疗“京尼萨库”病的代表性方剂，始载于《四部医典》，由姜黄、小檗皮、余甘子、蒺藜四味药材组成[3]，被收录于《卫生部药品标准·藏药》[4]。现代药理研究发现藏药四味姜黄汤能有效拮抗VEGF的活性和对抗肾小球基底膜增厚，对糖尿病肾病大鼠肾损伤有保护作用[5]，为治疗糖尿病肾病提供了实验依据，但四味姜黄汤治疗糖尿病肾病的众多机制及活性成分尚不清楚。鉴于此，本研究基于藏药药性理论和系统生物学理论，采用网络药理学和生物信息学方法，揭示藏药四味姜黄汤治疗糖尿病肾病的主要活性成分及作用机制，为后续研究提供参考[6]。

1 材料与方法

1.1 挖掘四味姜黄汤主治疾病的分布情况及“味性化味”分析 收集2018年6月3日至2019年3月3日的青海省藏医院国医大师尼玛门诊病历中四味姜黄汤主治疾病信息，分析其治疗疾病分布情况，利用藏药“味性化味”理论和Cytoscape软件构建藏药味-化味-效-性-“三因”的网络图。

1.2 四味姜黄汤的化合物及成分筛选 本文通过采用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-like，DL)≥0.18作为筛选条件[7-8]，结合诸多药理及化学成分研究的文献分析，查找并获取姜黄、小檗皮、余甘子、蒺藜等四味藏药材中符合要求的化合物。

1.3 化合物靶点的获取 根据筛选出来的化合物在Pubchem数据库中查找其Canonical SMILES结构，上传至Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、STITCH(http://stitch.embl.de/)数据库获取靶点信息，并进一步在UniProt数据库进行靶基因注释及确认，利用Cytoscape 3.7.1软件构建成分-靶点网络图。

1.4 交集基因的收集和药物-成分-基因-疾病网络的构建 以diabetic nephropathy为检索词，在人类基因数据库Genecards(https://www.genecards.org/)和人类孟德尔遗传数据库OMIM(https://omim.org/)检索与糖尿病肾病相关的疾病靶点进行整合和去重处理，获取四味姜黄汤与糖尿病肾病的交集基因，并进一步构建药物-成分-基因-疾病网络。

1.5 蛋白互作网络(PPI)的构建与分析 将交集靶点上传至String数据库(https://string-db.org/)，物种选为Homosapiens，评分条件设定为0.4，利用Cytoscape软件绘制蛋白互作网络图。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析 将关键靶点导入人类基因组注释数据库DAVID ver.6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)，进行基因本位论(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，设定阈值P<0.05[9]，筛选GO富集中每个组分P值排名前5和KEGG通路分析前20的结果，并应用KEGG mapper工具构建主要信号通路的通路图。

1.7 分子对接 应用Pubchem数据库下载活性成分的3D结构并以mol2格式保存，从PBD数据库(http://www.rcsb.org/)下载核心靶标的PDB格式文件。运用分子对接软件对蛋白质进行预处理，进行蛋白质氨基酸残基的修复、Protonate 3D加氢加电荷操作、设置力场参数、删除水分子、能量最小化，之后对配体进行能量最小化操作，最后选择基于蛋白和配体间相互作用能的打分函数ASE，分别得到每个化合物与受体的对接打分值，打分值越低，配体与受体结合越稳定。

2 结果

2.1 分析疾病分布情况及构建 “味性化味”网络图 从收集得到的320例临床数据分析得出，四味姜黄汤的主治疾病中藏医“京尼萨库”病(糖尿病)的频次最高(84次)(表1)，此外，“查隆”病(相当于现代医学的血液循环系统疾病如微循环障碍性疾病和血压异常性疾病)、“培查”病(相当于现代医学的高脂血症及代谢性疾病)和肾热病(相当于现代医学的轻度肾炎)的治疗频次也很高，分别出现了24、17次和14次。根据四味姜黄汤的 “味”和“化味”、剂量比值[3]构建作用于京尼萨库的网络图(图1)，结果显示，四味姜黄汤方剂的味性特症为六味中以甘、涩为主，三化味中以苦化味为主，十七效中以重(21.32)、钝(19.7)、稳(15.15)、干(14.01)、润(13.15)、轻(12.41)和凉(12)为主，通过干预疾病的热(29.9)、锐(21.1)、臭(17)、动(13.15)、重(9.61)等药性，起到以清“赤巴”为主(61.51)、调和“隆”为关键(58.62)、息“培根”为基础(41.24)的治疗目的。

表1 四味姜黄汤主治疾病的分布情况(频次>9)

图1 药物-味化味-效-特性-三因网络图

2.2 筛选四味姜黄汤的化合物 通过分析文献及TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction数据库为根据，确定了四味姜黄汤的21个活性成分(山柰酚为小檗皮和蒺藜共同化合物)，将整理好的化合物分别上传至Pubchem数据库获取分子式、Canonical SMILES、CAS号等信息(表2)。

2.3 作用靶点的筛选 将化合物的Canonical SMILE结构逐一上传至Swiss Target Prediction数据库获取靶点，进一步使用Uniport数据库对其进行矫正统一和去重处理，得到靶点分别为姜黄50个、小檗皮48个、余甘子99个、蒺藜58个。使用Cytoscape 3.7.1软件构建化合物-靶点网络图(图2)和计算相关网络属性，图中内圈表示度值≥5的基因，其余是度值<5的基因。该网络由159个节点和468个边构成，化合物中与20个以上靶点相连的有13个，其中与活性成分山柰酚相连接的靶点高达46个，与10个以上化合物相互作用的靶点有BACE1、ESR2、ACHE、ESR1、ALOX5、GSK3B等。

表2 四味姜黄汤的化合物信息

图2 四味姜黄汤的化合物-靶点的网络图

2.4 交集基因的收集和药物-成分-基因-疾病网络构建 通过Genecards和OMIM数据库检索与糖尿病肾病有关的所有靶点，并计算与糖尿病肾病的交集基因，其中姜黄与糖尿病肾病的交集基因23个，小檗皮与糖尿病肾病的交集基因27个，余甘子与糖尿病肾病的交集基因53个，蒺藜与糖尿病肾病的交集基因31个，去重处理后得交集基因68个，并利用Cytoscape软件构建了四味姜黄汤防治糖尿病肾病的药物-成分-靶点-疾病网络图，见图3，该网络由93个节点和352条边构成，平均度值为7.56。

图3 四味姜黄汤散的药物-成分-靶点-疾病网络图

2.5 四味姜黄汤PPI蛋白互作网络构建与分析 将68个交集基因上传至String数据库构建作用靶点互作网络，见图4，此网络中的交集靶点相互作用产生了290条蛋白互作的边，度值≥13的有15个核心基因，见图5，其中VEGFA(38)、CASP3(35)、HSP90AA1(34)、ESR1(26)、MTOR(24)的度值较高，推测这些靶点可能是防治糖尿病肾病的关键靶点。

图5 四味姜黄汤散PPI核心基因柱状图

2.6 四味姜黄汤GO生物功能和KEGG通路富集分析 GO功能分析结果显示四味姜黄汤参与28个生物过程、8个细胞组分、12个分子功能，根据P值分别列出了GO富集分析中排名前5的结果(图6)，主要涉及的生物过程有Positive regulation of phospholipase C activity (4个靶点)、Transcription, DNA-templated(7个靶点)、Positive regulation of protein kinase B signaling(4个靶点)、Protein autophosphorylation(5个靶点)、positive regulation of MAP kinase activity(3个靶点)。涉及的细胞组分有Endosome(5个靶点)、Cytosol(10个靶点)、Nucleus(16个靶点)、Extracellular space(7个靶点)、Intrinsic component of plasma membrane(2个靶点)。涉及的分子功能有ATP binding(17个靶点)、Protein serine/threonine kinase activity(7个靶点)、Cyclin-dependent protein serine/threonine kinase activity(3个靶点)、Steroid binding(3个靶点)、Sequence-specific DNA binding(6个靶点)。表明四味姜黄汤参与体内多种生物学调控过程以发挥防治糖尿病肾病的作用。

图6 交集基因GO富集条形图分析

KEGG通路分析结果显示，四味姜黄汤的交集基因共涉及45条信号通路过程，根据P值列出了排名前20的通路(见图7)，分别有PI3K-Akt信号通路、黏附、癌症相关通路、MAPK信号通路、细胞骨架、AGE-RAGE信号通路和P53信号通路等。选择主要信号通路PI3K-Akt(15个靶点)绘制通路图，见图8。

图7 四味姜黄汤活性成分通路富集分析气泡图

2.7 活性成分和核心靶标分子对接预测 如表3、图9所示，化合物谷甾醇、豆甾醇、余甘根苷A和蛋白VEGFA, 化合物谷甾醇和蛋白CASP3均有较好的结合活性，对接分值分别为-33.047、-31.554、-29.729、-29.929。从2D和3D对接图可见，上述四个化合物与蛋白VEGFA、CASP3结合至少形成了一个氢键相互作用力，如化合物谷甾醇与VEGFA中的Gly922形成了1个氢键，化合物余甘根苷A与VEGFA中的Glu885、leu840、Val899形成了3个氢键，与Cys919形成π-H共轭，正是因为这些氢键的π-H共轭键的存在，导致化合物与蛋白的对接打分值非常低，甚至有些化合物与原配体的对接打分值还要低，这充分说明化合物与蛋白能够稳定的结合。其余化合物虽未与蛋白形成相互作用力，但从对接打分值来看，剩余化合物与蛋白的对接打分值比其与原配体的对接打分值还低，形成的主要原因可能是这些化合物基本全部包裹在活性口袋之中，这也为剩余化合物与蛋白能够稳定结合提供了证据。

3 讨论

通过藏医“味性化味”理论分析藏药四味姜黄汤的药性，发现四味姜黄汤方剂的味性特征主为六味中主显甘味和涩味，三化味中主显苦化味。根据藏医药性理论，苦、涩味和苦化味主治“赤巴”病。本方剂的十七效特征以重(21.3)、钝(19.7)、稳(15.2)、干(14.0)、润(13.2)、轻(12.4)、凉(12.0)为主，主要作用于藏医“隆”病的轻、锐、动和硬、细等属性，“赤巴”病的热、泻、湿等属性，“培根”病的重等属性；基于三化味的十七效以凉(29.9)、重(21.3)、钝(21.1)、稀(17.0)、稳(13.2)、润(13.2)为主，主要作用于“赤巴”病的热和臭等属性，“隆”病的轻、锐、动、硬和细等属性。根据药物的十七效与“隆”“赤巴”“培根”三病的二十属性之间的平衡治疗关系，药性钝、干、凉主治“赤巴”病，重、稳、润主治“隆”病，轻主治“培根”病，表明四味姜黄汤治疗糖尿病肾病遵循以清“赤巴”热为主、调“隆”通血气为关键、消“培根”之重和腻性为根本的治疗原则，从而实现维持藏医“三火”生理功能、顺通血液循环的京尼萨库及糖尿病肾病防治。

图8 PI3K-Akt信号通路图

本研究通过“成分-靶点”网络模型的预测发现四味姜黄汤发挥作用的主要成分有20个，其中姜黄素、小檗碱、鞣花酸、山柰酚、木犀草素、表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素等7种活性成分均已被报道具有防治糖尿病及糖尿病肾病的作用。姜黄素为姜黄的主要成分，是通过降低IL-17、VEGF等炎性因子水平和氧化应激，减少肾小球分泌LN和Col4，延缓ECM的积聚，减轻肾小球病理变化，从而对肾脏起到一定程度的保护作用[10-11]。小檗碱治疗糖尿病肾病的作用主要集中于降血糖、改善血流动力学、降血脂、抗炎等方面[12-14]。鞣花酸通过减轻糖尿病肾病小鼠机体氧化应激和减少MDA对细胞造成的不可逆转的损伤，有助于机体维持正常生理功能，缓解糖尿病肾病导致的肾损伤[15]。山柰酚对高糖诱导的HBZY-1细胞增殖起抑制作用，并通过分子生物学实验，初步证实其作用的分子机制可能是通过抑制p38 MAPK信号通路，从而抑制HBZY-1细胞的增殖以及细胞外基质的聚集[16]，另外可抑制糖尿病肾病大鼠肾组织炎症反应和细胞凋亡，对肾功能和组织病理损伤具有保护作用[17-18]。通过实验推测，木犀草素是通过提高机体的抗氧化能力，抑制肾组织TGF-β1和PAI-1蛋白表达来减轻糖尿病肾脏ECM的过度积聚，对糖尿病肾脏起到保护作用[19]。EGCG可以抑制异常糖代谢引起的氧化应激反应，减轻糖毒性及肾脏损伤[20]。槲皮素是通过改善氧化应激和抗炎的作用机制，对早期糖尿病肾病起到保护作用[21-23]，以上研究报道与本文预测的结果存在一致性，明确了本次网络药理学和生物信息学预测的可靠性，为今后继续研究相关成分对抗糖尿病肾病的作用机制提供了重要依据。

表3 活性成分和核心靶标分子对接分值表

图9 四味姜黄汤散与糖尿病肾病核心靶点分子对接结果图

依据四味姜黄汤PPI互作网络分析得出，主要靶点为VEGFA、CASP3、HSP90AA1、ESR1等，VEGF在肾脏表达于肾小球足细胞、远端肾小管和集合管，在近端肾小管也有少量表达[24]，可以促进血管发生、血管形成、内皮细胞增殖、迁移和增强血管通透性[25]，因此，四味姜黄汤通过调节VEGF诱导血管新生，保护血管，从而改善糖尿病肾病。CASP3参与细胞凋亡效应[26]，阻断CASP3基因的表达对肾脏具有保护作用[27-28]。Hsp90是广泛存在于生物体内一种高度保守的伴侣分子[29]，在早期糖尿病肾病大鼠的发生发展中起非常重要的作用，主要是Hsp90α与eNOS相互作用，使eNOS与Caveolin-1解离减少，或者可能通过PI3K/Akt通路，降低eNOS Ser1177磷酸化蛋白表达，降低内皮细胞eNOS酶活性，引起内皮功能障碍[30]，揭示Hsp90α通过调节内皮细胞功能防治糖尿病肾病的血管病变。雌激素与经典受体结合作用于基因组，防止胰岛B细胞凋亡，使其分泌的胰岛素增加，进而降低血糖，同时，还可以与非典型的受体结合，通过众多级联反映促进胰岛素分泌，增加胰岛素敏感性来防治糖尿病肾病[31]。

GO注释结果表明，生物功能主要富集在磷脂酶C活性和蛋白激酶B信号通路的正调控、血清蛋白/三丝质激酶活动、序列特异性糖尿病肾病A结合MAP激酶活性的正调控、ATP结合等。KEGG通路主要富集在PI3K-Akt信号通路、黏附、癌症相关通路、MAPK信号通路等，其中PI3K/Akt信号通路是抑制细胞凋亡的重要信号通路[32]，表明四味姜黄汤多通路防治糖尿病肾病。分子对接结果表明，活性成分谷甾醇、豆甾醇、余甘根苷A与VEGFA、 CASP3核心蛋白之间形成了氢键和π-H共轭键等相互作用力，且结合亲和力较强，具有潜在的研究价值。

综上所述，本研究应用藏医“味性化味”理论和生物信息学方法，分析了藏药四味姜黄汤防治糖尿病肾病的作用机制，藏药药性理论、网络药理学和生物信息学分析结果相互支持，体现了藏药多成分、多靶点、多个通路协同作用的的特点，为下一步开展四味姜黄汤治疗糖尿病肾病的机制研究提供了方向。鉴于此，本课题后续将结合分子生物学和病理生理学等方法，继续开展藏药四味姜黄汤防治糖尿病肾病的机制研究。