补肾活血方干预小鼠膝骨关节炎软骨修复的机制

李 兴， 肖方骏， 李 震， 翁家贤， 罗明辉， 潘建科， 陈红云， 杨伟毅*

(1.广州中医药大学第二附属医院运动医学科，广东 广州 510120；2.广州中医药大学，广东 广州 510405)

膝骨关节炎好发于中老年人群，是临床中发病率较高的一种退行性膝关节疾患，以膝关节软骨的变性、破坏及骨赘形成为主要临床特征，临床上患者常以膝关节出现反复的疼痛、爬楼梯或下蹲困难为主诉，严重者，后期可发展为关节畸形，致残率高达53%，给患者的工作和生活造成了严重的干扰[1-2]。目前，针对膝骨关节炎主要治疗包括保守方案及手术方案，但尚无特效的治疗方法，而中医药在保守治疗方面有着巨大的潜力。补肾活血方源自于广东省中医院院内制剂肾骨安，前期的研究已证实了其临床疗效[3-4]，本研究意图借助病理学、分子生物学、影像学等多学科联合手段，研究补肾活血方对小鼠膝关节骨关节炎模型的干预作用，并进一步探究其作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级10周龄C57BL/6雄性小鼠32只，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(粤)2018-0034，饲养于广州中医药大学SPF动物实验中心，实验动物伦理审查号20200911001，实验动物使用许可证号SYXK(粤)2018-001，自由摄水饮食，昼夜节律为12 h/12 h，环境温度 (24±2) ℃，相对湿度55%～68%，适应性喂养1周后开始进行实验研究。

1.2 药物 补肾活血方每剂含丹参15 g，巴戟天10 g，仙茅10 g，熟附子10 g，由广州中医药大学第二附属医院提供。

1.3 试剂及仪器 胶原蛋白Ⅱ(Collagen Ⅱ)(货号gb12021)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)抗体(货号gb11247)均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；DAB Substrate Kit(货号8059S)购自美国Cell Signaling Technology公司；番红O-固绿软骨染色试剂盒(货号G1371)购自北京索莱宝科技有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(货号TRR820A)、Reverse Transcription Kit(货号TRR820A)、PrimeScriptTMRT reagent Kit(货号RR037A)均购自日本Takara公司。倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；Micro-CT(型号Skyscan 1172，德国Bruker公司)。

2 方法

2.1 动物模型建立与分组 按照随机数字表法将32只小鼠分为假手术组、模型组、补肾活血方低剂量组和补肾活血方高剂量组，每组8只。根据文献方法制备膝骨关节炎模型[5-6]小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠(35 mg/kg)进行全身麻醉，将小鼠固定、备皮、消毒，随后使用内侧髌旁入路暴露右膝，将髌骨后翻, 使膝关节保持最大屈曲状态, 暴露关节腔, 利用显微器械切断膝前交叉韧带, 避免损伤软骨, 切断后用抽屉实验检验前交叉韧带是否被切断。8周后，处死小鼠，取出膝关节并固定在4%多聚甲醛中用于后续实验。

2.2 给药方法 造模成功后，次日开始对给药组进行灌胃干预，每天1次，每6 d间歇1 d。补肾活血方低、高剂量组分别给予0.46、0.92 g/mL的补肾活血方进行灌胃，每次每只小鼠灌胃0.3 mL，假手术组及模型组分别给予0.3 mL蒸馏水进行灌胃，连续干预8周。

2.3 组织学观察 将组织样品转移到10% EDTA溶液中进行完全脱钙、脱水和石蜡包埋。在膝关节内侧隔室中沿矢状面方向切成5 μm厚，并用苏木精和伊红(HE)和番红-固绿(safranin O-fast green staining，SO)染色。通过应用OARSI评分系统[7]评价小鼠关节软骨的退变程度。0分为表面完整，软骨完好无损；1分为表面完整；2分为表面不连续；3分为垂直裂缝；4分为侵蚀；5分为剥蚀；6分为变形。将内侧股骨和胫骨平台分数相加(0～12分)以评价关节软骨退变的程度。

2.4 RT-qPCR法检测小鼠关节软骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、MMP13 mRNA表达 按照Trizol法提取总RNA，各组RNA取500 ng按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书进行逆转录，并进行RT-qPCR分析，参数为 95 ℃ 30 s，预变性;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，扩增40个循环。参考熔解曲线为依据进行质控，检测样品中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α及MMP13的mRNA表达，并以GAPDH作为内参，使用2-△△CT法分析结果。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 免疫组化检测小鼠关节软骨中Collagen Ⅱ、MMP-13蛋白表达 小鼠组织切片脱蜡、抗原修复、血清封闭后，用兔多克隆抗体工作液稀释的Collagen Ⅱ、MMP-13抗体(1∶100)进行孵育，再将其与二抗工作液一起孵育，最终显色试剂显色，复染苏木精后，切片脱水、封片。镜下观察，并采集图像，然后通过Image J 软件对阳性点进行定量，计算每个标本的阳性染色细胞数，每组小鼠取3个连续标本进行分析。

2.6 Micro-CT扫描评价小鼠膝关节中骨小梁破坏及附近骨赘增生状况 将样本置于含有70%乙醇的离心管中，并使用Micro-CT进行扫描[8-9]。将整个胫骨平台软骨下骨组织设置为兴趣区域(region of interest，ROI)，并采集膝关节的解剖结构三维重建的图像，采集相关的组织学参数，骨体积(bone volume, BV)、骨体积/总组织体积(bone volume/total tissue volume,BV/TV)和骨小梁数量(trabecular.number,Tb.N)、厚度(trabecula.thickness,Tb.Th)和间距(trabecular.separation,Tb.Sp)。

3 结果

3.1 补肾活血方对小鼠关节软骨病理HE、SO染色及评分的影响 如图1A～1B所示，模型组小鼠关节软骨部分区域出现明显缺损，补肾活血方低剂量组小鼠关节软骨表面磨损较模型组有所减轻，而补肾活血方高剂量组小鼠软骨表面可见侵蚀现象明显改善。评分如图1C所示，与假手术组比较，模型组小鼠OARSI评分升高(P<0.05)，提示小鼠造模成功；与模型组比较，补肾活血方低、高剂量组小鼠评分降低(P<0.05)。

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。比例尺50 μm。图1 各组小鼠关节软骨病理染色及评分图(×20)

3.2 补肾活血方对小鼠关节软骨中COX-2、iNOS、MMP13、TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响 如图2所示，与假手术组比较，模型组小鼠关节软骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、MMP13 mRNA表达升高(P<0.05);与模型组比较，补肾活血方低、高剂量组小鼠关节软骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、MMP13 mRNA表达降低(P<0.05)。

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。图2 各组小鼠关节软骨中COX-2、iNOS、MMP13、TNF-α、IL-6 mRNA表达

3.3 补肾活血方对小鼠关节软骨中Collagen Ⅱ、MMP-13蛋白表达的影响 如图3所示，与假手术组比较，模型组小鼠关节软骨中MMP-13的阳性表达增加(P<0.05)，Collagen Ⅱ的阳性表达降低(P<0.05)；与模型组比较，补肾活血方低、高剂量组小鼠关节软骨中MMP-13的阳性表达降低(P<0.05)，Collagen Ⅱ的阳性表达增加(P<0.05)。结果表明，使用补肾活血方后，小鼠关节软骨损伤的现象明显改善。

3.4 补肾活血方提高小鼠膝关节中骨小梁密度及减少关节周围骨赘增生 Micro-CT扫描三维重建结果如图4A所示，假手术组小鼠膝关节软骨均是健康软骨，未见明显的骨质破坏及增生；而模型组及补肾活血方低、高剂量组小鼠膝关节软骨均有不同程度的变化。从膝关节内侧矢状面图像(图4B)分析，假手术组小鼠膝关节下骨小梁连续、密集、完整；模型组小鼠膝关节骨小梁不完整、疏松并断裂；与模型组比较，补肾活血方低、高剂量组小鼠膝关节在矢状位上骨小梁厚度明显增加。从骨计量参数分析的结果(图4C)来看，与假手术组比较，模型组小鼠ROI区域的BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N水平均下降(P<0.05)，Tb.Sp水平升高(P<0.05)；与模型组比较，补肾活血方低、高剂量组小鼠ROI区域的BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N水平均升高(P<0.05)，Tb.Sp水平下降(P<0.05)。结果表明，补肾活血方能够改善关节炎小鼠ROI区域的BV、BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th、Tb.N水平。

4 讨论

注：A～B为MMP-13、Collagen Ⅱ免疫组化染色，C～D为MMP-13、Collagen Ⅱ免疫组化染色直方图。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。比例尺50 μm。图3 各组小鼠关节软骨中MMP-13、Collagen Ⅱ蛋白表达(×20)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。比例尺50 μm。图4 各组小鼠关节软骨Micro-CT扫描结果

中医古籍中并无膝骨关节炎这一称谓，根据其相关症状，多将其从“骨痹”论治[10-11]，《素问》中记载，“肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极”，首先提出在中老年患者膝骨关节炎中，肝肾不足是其基本病机。同时，气血作为人体的基本营养物质，但凡损伤，必有气血运行障碍，诚如《正体类要》中所言“肢体损于外，则气血伤于内”。因而，当前对膝骨关节炎中医病因病机的认识，多以肾虚血瘀为主，以补肾活血法治之[12-13]。本研究以此为理论基础，采用的补肾活血方是根据广东省名中医邓晋丰教授多年临床经验所创制，全方由巴戟天、丹参、熟附子、仙茅四药组成，寒热兼施，有补肾强筋，活血通络之功效，临床疗效显著[3-4]。同时，现代药理学研究证实，中药丹参[14]和附子[15]的活性成分可以有效抑制炎性因子释放，而其干预膝骨关节炎的机制可能与减少MMPs释放，进而抑制关节软骨基质的降解有关。

MMPs是细胞外基质降解中主要的蛋白酶系统，被认为是机体生理重建和病理破坏的主要基础因素之一[16]。MMP-13作为已知酶系中最高效的胶原酶，可以直接降解软骨基质中的Collagen Ⅱ，在膝骨关节炎病理过程中，MMP-13常呈过表达的状态，造成细胞外基质的过度降解，使软骨的完整性破坏[17]。因此，理论上来说，软骨破坏程度越严重，MMP13的表达越高[18]。同时，既往研究发现，IL-6、TNF-α等炎性因子可以通过不同途径活化MMPs[19-20]。本研究通过实验发现膝骨关节炎模型小鼠关节软骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α等炎性相关因子与MMP-13的mRNA表达均有不同程度增高，与文献结果一致。

根据本研究中HE染色、SO染色及Micro-CT的结果，发现造模后的C57BL/6小鼠出现了显著的关节软骨增生，及软骨下骨破坏的组织学改变，符合膝骨关节炎的特点。补肾活血方干预8周后，与模型组比较，补肾活血方低、高剂量组有着不同程度的改善小鼠膝骨关节炎组织学形态的作用。同时，RT-qPCR、免疫组化的结果发现，与模型组比较，低剂量组、高剂量组小鼠关节软骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、MMP13 mRNA表达降低(P<0.05)，而Collagen Ⅱ表达高(P<0.05)。同时，本研究还发现补肾活血方在治疗膝骨关节炎过程中存在剂量相关性，随着用药剂量增加，膝骨关节炎小鼠的炎性因子表达降低。

综上所述，本研究发现补肾活血方可以有效减缓膝骨关节炎的软骨损伤，其机制可能是通过抑制炎性因子的表达，进而减少MMP-13的释放，阻止MMP-13对软骨基质中Collagen Ⅱ的破坏，从而达到改善关节软骨内代谢环境，保护关节软骨的作用。本研究结果可能是补肾活血方改善膝骨关节炎的一种新型机制，但未来仍需更多的实验研究及临床论证，来进一步挖掘其更深入的机制。