贝母属多糖分离、鉴定、生物活性研究进展

赵宏权， 王知斌， 孙延平， 杨春娟， 杨炳友， 匡海学*

(1.黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨医科大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150081)

贝母属植物在中国分布约80种，变种及变型约50多个[1]，2020年版《中国药典》中贝母属植物的入药部位为干燥鳞茎，国内植物资源主要分布于浙江、四川、黑龙江、新疆、甘肃、湖北、安徽等省[2]。在历史进展中多数贝母在药用和食用方面不断被开发和应用[3]。随着对贝母药用资源的研究深入，人们在贝母属中药中发现了生物碱、萜类、皂苷、多糖、微量元素、嘧啶与嘌呤类以及核苷类成分。多糖广泛存在于动物、植物、真菌、微生物体中[4]，其中对人体生理功能有调节作用的特异性多糖[5]在免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂[6]、抗衰老、抗溃疡、降血糖、降血脂、抗凝血[7]、心脑血管系统疾病、抗炎、抗辐射[8]等方面发挥作用。另外，多糖作为重要的生物活性物质在食品、动物养殖[9]、美容、乳化[10]等领域有着广阔的应用前景，具有比较高的开发潜力和研究意义。本文通过对浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母、川贝母、甘肃贝母、瓦布贝母、太白贝母、暗紫贝母、梭砂贝母在多糖的分离、鉴定、生物活性方面进行综述，以期为贝母属多糖的研究开发及利用提供参考。

1 制备

1.1 提取

1.1.1 水提醇沉法 水提醇沉法是从植物中提取多糖的常用方法。用该法提取太白贝母多糖，采用响应面法设计提取工艺，对料液比、提取时间和提取温度进行优化，结果显示太白贝母多糖最优工艺参数为料液比1∶16.3，提取温度84.2 ℃，提取时间1.6 h，提取率1.267%[11]；用相同方法得出神农贝母多糖提取工艺的最佳条件为料液比1∶50，提取温度90 ℃，提取时间4 h[12]。正交试验设计浙贝母多糖最佳提取工艺，得出其工艺参数为料液比1∶50，提取温度90 ℃，提取时间2.5 h，平均提取率7.43%[13]；而用单因素和3因素3水平正交试验设计不同贝母多糖的提取优化热水提取条件，其结果表明提取的有效顺序为提取温度>原料液比>提取时间，工艺参数为料液比1∶30，提取温度90 ℃，提取时间3 h[14]。水提醇沉法作为常用的提取方法有着安全，成本低，操作简单等优点，但同时也存在提取时间长，纯度较低等缺点。

1.1.2 酸碱提取法 在酸碱提取法的应用上通过将伊贝母脱脂粉末用水、酸(柠檬酸)和碱(氢氧化钠)进行连续提取，并将残留物进行下一步提取，得到4种伊贝母粗多糖，分别为FPSP-C、FPSP-H、FPSP-CA、FPSP-A[15]。酸碱提取法在一定程度可以提高提取效率，得到更多的多糖，但同时要考虑多糖和酸、碱之间的适用性，以防酸、碱对多糖产生降解作用。

1.1.3 微波提取法 微波提取法是从天然植物、矿物或动物组织中提取天然化合物及生物活性成分的方法，该法有着快速高效、加热均匀、不易使成分分解、应用面广等优点。甘孜川贝母在微波提取法的基础上通过正交试验，得出其多糖的最佳提取工艺参数为料液比1∶30，提取温度90 ℃，微波时间3 min，该提取法提高了贝母多糖的提取率[16]。

1.1.4 超声提取法 超声波提取在中药材工艺方面的应用已经十分广泛。在提取效率、时间、温度等方面，超声波提取与传统提取方法相比有较大的优势。响应面法设计太白贝母多糖提取工艺，得出最佳提取工艺参数为料液比1∶15，提取温度75 ℃，超声提取时间16 min，总糖含量0.46%[17]；而通过正交试验设计太白贝母多糖提取工艺，同时考察水浴、超声、煎煮法对其多糖含量影响，得出超声波法工艺参数为料液比1∶15，提取温度80 ℃，提取时间15 min，其效果明显优于其他2种方法[18]。

1.1.5 其他 在提取方法中，超声提取法与酶提取法的联用也有被使用，如分别采用超声波辅助提取法(UA)、纤维素酶辅助提取法(CA)、纤维素酶-超声辅助提取法(CUA)、果胶酶-超声辅助提取法(PUA)对伊贝母多糖提取率进行考察，结果表明，CUA法提取率最高为(20.65±0.78)%，其中碳水化合物(56.16±0.38)%、糖醛酸(28.34±0.23)%[19]。

1.2 分离纯化 为获得均匀的多糖，需要除去蛋白质、色素，以及无机盐、单糖、低聚糖、氨基酸和部分色素等小分子物质[20]。其中蛋白质杂质对多糖的纯度和生物活性有较大的影响[21]，传统除蛋白质的方法有Sevag试剂法、三氯乙酸法(TCA)、酶法等[22]，新型脱蛋白方法主要包括冻融法、双醛纤维素法、磁性壳聚糖微球法、CaCl2法、树脂吸附法和醋酸铅法[23]。大量色素影响多糖的色谱分析和性质测定，常用脱色方法有吸附法、氧化法、离子交换法、大孔吸附树脂法等[24]。此外去除鞣质色素一般使用活性炭吸附法以及分离脱色兼得的DEAE纤维素吸附法[22]。透析是除去小分子杂质的有效手段[20]。

在分离纯化过程中，一般会进行脱脂前处理或根据需要去除生物碱、皂苷等成分。如石油醚及二氯甲烷对瓦布贝母(FUW)粗多糖进行脱脂，S-8大孔树脂脱色，蛋白酶、Sevag试剂脱蛋白，水透析以除去小分子物质，Sepharose G-150凝胶过滤柱进一步纯化级分[25]。相同的是伊贝母粗多糖溶解在蒸馏水中，进行相同的脱蛋白以及除小分子杂质处理，不同的是利用α-淀粉酶除去淀粉，DEAE-52色谱柱、Sephadex G-100色谱柱进一步分离，根据收集到的样品的峰位，从而获得纯化的多糖级分[15]。通过对核酸、蛋白、色素脱除率以及多糖损失率和羟基自由基清除效果进行纯化效果考察分析，将太白贝母和甘孜川贝母多糖提取液经过4种不同类型树脂静态吸附纯化，结果显示，纯化效果最佳的树脂类型排序为201×4型树脂>AB-8型树脂>DA201-C型>HPD600型大孔树脂[26]，而从4种不同预处理大孔树脂对相同2种贝母纯化效果来看，大孔树脂需浸泡24 h以上且有必要进行加酸碱处理，才能有较好的纯化效果[27]，这可以看出进行除杂的手段基本为传统方法之间的联用，进一步纯化则是采用柱色谱法，这在很大程度上提高了多糖的纯度。具体信息见表1。

表1 贝母多糖分离纯化表

2 结构解析

多糖的分子量、单糖的连接顺序以及空间构象等决定了其生物功能活性[33]。近年来通过物理、化学、仪器分析、生物技术及酶学等方法，以及各方法之间的联用技术让人们对植物多糖的结构有了较为深入的了解[34]。

对贝母属中药多糖结构的解析方法有紫外吸收光谱法(UV)、高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振波谱法(NMR)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、气质联用法(GC-MS)、扫描电子显微镜(SEM)、X 射线衍射法(XRD)、薄层色谱法(TLC)、高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、热分析法(TA)和刚果红染色法等。其中UV法可以提供多糖、糖醛酸以及蛋白质的信息；HPGPC法、GC法可以提供多糖分子量信息；单糖组成信息可由酸水解、TLC法、HPLC法、GC-MS法分析提供；糖环类型及构型信息可由IR法、NMR法分析提供；SEM法可观察物质表面的微观形貌；XRD法对多糖是否为晶体结构进行分析；热分析法可对多糖的热稳性进行判断；刚果红染色法、UV法的使用可以分析多糖的构象；糖残基类型及糖苷键连接位点信息可由甲基化反应与GC-MS法联用分析提供[5]。

研究采用傅里叶红外光谱(FTIR)法显示关键的官能团，SEM法、XRD法、刚果红试验显示伊贝母多糖的特征结构[19]。IR法、HPLC法对平贝母水溶性多糖FUP-1结构和单糖组成进行初步分析[31]。也有研究通过比较多元醇乙酸酯和标准糖的保留时间确定伊贝母多糖的单糖组成，伊贝母多糖FPSP-N结构经FTIR光谱和GC表征结果表明分离的化合物为杂多糖[28]。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生HPLC法所测不同贝母样品的单糖组成相同，但比例不同[14]。而从存在不易确定的热化学和晶形结构上得出热稳定性的差异可能是由于提取、纯化方法和分子构象、单糖组成、多糖级分结构之间的差异引起的，伊贝母多糖XRD法显示多糖既有结晶性也有非晶态性质[15]。其中较为深入的研究是，瓦布贝母多糖FWPS1-1经I2-KI与UV结合测定，结果表明其具有更多的分支和更长的侧链，偏酸水解可用于分析多糖的侧链和主链的单糖组成，与主链相比，多糖的侧链键通常更容易被酸水解[25]。根据目前已有文献报道，贝母多糖研究多集中在伊贝母，其研究结果较为丰富，而除此之外的贝母多糖研究较为不足，已有信息表明其共同之处在构型上多属于α构型吡喃糖。详细的多糖信息特征见表2。

表2 贝母属多糖结构信息特征表

续表2

3 生物活性

3.1 抗氧化 现代研究中药抗氧化的机制为①在细胞水平上可以从自由基、抗氧化酶活性、脂质代谢产物、细胞器和细胞凋亡方面阐述抗氧化作用[36]；②在基因表达层面开展研究论述如调节抗氧化酶基因的表达及抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA 表达,从而增强抗氧化能力[37]；③研究信号通路可缓解氧化应激损伤以及清除机体或细胞内自由基，提高抗氧化酶活性或水平，增强机体或细胞对氧化应激的抗性[38]。

太白贝母多糖(PFT)体外抗氧化实验发现，PFT对清除DPPH自由基和ABTS自由基具有显著的清除作用，并随着提取物浓度的增加而加强，其抗氧化能力可能与提取物中其他成分(如生物碱)的协同作用有关[39]。而同样的体外研究中瓦布贝母多糖(FWPS1-1)表现出弱的DPPH自由基清除活性和低FRAP能力，但具有高的ABTS自由基清除活性和Fe(Ⅱ)螯合能力以及DNA损伤保护活性，具有良好的抗氧化活性和DNA保护作用[25]。在体内抗氧化研究中发现平贝母多糖(FUP-1)表现出较强的羟基、超氧阴离子和DPPH清除自由基的活性。可以大大减少丙二醛(MDA)的增加，更新血清中的超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，提高小鼠肝脏中的抗氧化能力(T-AOC)，这表明FUP-1不仅通过自身的自由基清除活性发挥抗氧化作用，而且还通过增强宿主的酶促和非酶促抗氧化剂防御系统发挥作用[30]，可以看出贝母多糖在多方面发挥抗氧化作用。

此外还可以对多糖进行修饰，改变其结构和部分理化性质，从而改善多糖的活性[40]。对平贝母多糖(FUP)进行化学修饰，随后对得到的多糖铁配合物FUP-Fe进行研究，发现该多糖铁配合物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基有清除作用，并且均强于平贝母多糖，最大清除率分别为68.9%、57.3%、46.9%[41]。同样的，对平贝母多糖进行化学修饰，得到平贝母多糖锌配合物FUP-Zn，为评价该配合物的抗氧化能力，对羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力展开研究，结果发现FUP和Zn的结合使FUP-Zn配合物的抗氧化活性大大增强，且不同取代度的FUP-Zn配合物的抗氧化活性与锌的用量有很大关系[29]，可见多糖修饰对多糖活性产生了较大影响，为多糖活性研究提供了参考依据。

3.2 抗衰老 现代研究表明，衰老是由于基因功能紊乱、蛋白稳态失调、营养代谢信号发生改变、线粒体出现损伤和干细胞耗竭以及细胞与炎性衰老等原因造成的[42]。中药抗衰老主要是在抗自由基、调节免疫功能、调节神经-内分泌功能及抗DNA损伤等方面发挥作用，其他如基因表达、端粒研究也为研究的一大热点[43]。

目前药理学方法是研究降低机体衰老的方法之一[44]，中药多糖抗衰老机制研究多集中在建立实验动物模型[45]。MDA水平高低以及单胺氧化酶(MAO)活性是影响衰老的重要标志，研究通过由D-半乳糖诱导小鼠建立亚急性衰老小鼠模型，发现平贝母多糖(FUP-1)能降低MDA水平以及脑组织MAO活性，同时该多糖也能提高肝脏中的T-AOC、GSH-Px、SOD活性，表明FUP-1有抗衰老作用，但其同时也指出FUP-1可能不是通过直接抑制MAO活性而抗衰老的，其抗衰老作用可能与其提高抗氧化酶活性和抗脂质过氧化有关[46]。然而有研究认为FUP-1通过提高GSH-Px的活性和降低MDA水平来保护细胞，从而发挥抗衰老作用[47]。另外研究表明中药多糖成分抗衰老作用主要是通过增强抗氧化与机体免疫力、清除自由基、抑制衰老基因表达以及调控细胞周期[45]。

3.3 抗炎 具有抗炎作用的多糖主要是通过调节炎症细胞分泌的1种或多种炎症介质，平衡炎症部位的促炎因子与抗炎因子的水平，影响炎症发展过程的各个阶段[7]。发挥作用途径主要有丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的调节功能、干扰花生四烯酸代谢、抑制炎性介质、抗血栓生成等[48]。

白细胞渗出伴血管反应是炎症的重要标志，因此抑制或阻断白细胞向血管外组织的迁移是控制炎症发生的重要手段。在小鼠肿胀模型中用蛋清和二甲苯诱导小鼠踝部和耳廓肿胀，施加不同浓度的湖北贝母多糖(CPFK)可以减轻蛋清和二甲苯致小鼠肿胀的程度，发现主要是抑制体内炎性细胞因子分泌，维持体内促炎因子和抗炎因子的动态平衡。又通过HE染色，观察肝、肾组织病理学变化，结果显示CPFK可明显降低脂多糖(LPS)引起的炎症反应，降低了炎性细胞因子表达，最后表明CPFK对小鼠炎症有抗炎作用，在一定浓度范围内，多糖浓度越高，对炎症的治疗效果越明显，且在一定条件下，CPFK可减轻炎性渗出和水肿，从而减轻急性炎症时器官水肿和梗阻的病理改变[14]。

4 结论与展望

制备方面，酸碱提取法虽能提高多糖的提取率，但酸碱易使多糖降解及容器腐蚀，不利于工业生产；超声提取法也可因提取时间长而造成多糖糖链断裂[49]；微波法则会因辐射时间过长，系统温度升高使得溶剂大量损失[50]；超声-酶法在使用中需考虑酶的专一性、价格等问题；水提醇沉法有着设备方便、安全、溶剂便宜易回收等优点。考虑安全、设备、经济、工业化生产等问题，水提醇沉法仍是常用的提取方法。

在分离鉴定中，多采用Sevage法、大孔树脂法、透析法等进行除杂。柱层析法作为分离的有效手段，填料多为凝胶、离子交换型纤维素和离子交换凝胶，常用型号有葡聚糖凝胶、二乙氨基乙基纤维素、琼脂糖凝胶等，填料所具离子交换和分子筛作用性质对分离多糖具有较好的效果。现代波谱技术对解析多糖结构有很大优势，其中气质联用技术在复杂糖类物质定性定量分析方面具有样品选择性好、分析速度快等特点，但样品需要衍生化；液质联用技术省去对样品的衍生化处理，具备高准确度和低检出限的特点，用于多糖的组成分析、单糖及寡糖的定量与定性、寡糖及多糖的结构解析等。化学方法如甲基化分析等存在样品量多、操作繁琐、分析时间长，误差较大等缺点，但在如复杂多糖的降解上有着独特优点。在多糖的结构解析中，应以现代波谱技术分析为主，经典化学方法为辅的方式对多糖结构展开解析。

在贝母多糖结构解析中如糖链的研究，多糖生物活性如抗病毒、降血糖、抗肿瘤等的探究上还存在不足。一方面要继续优化贝母多糖的制备工艺，深入探究构效关系，探究如糖链构像、结构修饰中引入不同官能团以及多糖组成、分子量等对生物活性的影响；另一方面在糖生物学研究中，展开与中草药相结合的糖药物研究，既可以作为治疗疾病的药物，也可作为保健食品。研究这些以糖类为基础的药物，可以扩大贝母属中药多糖的应用范围，为制药、临床、工业生产等做好铺垫。