综合评估胎盘植入性疾病中CD200R1 的表达水平

尹春月 黄志广 何融泉 陈罡 龙禹

（广西医科大学第一附属医院 广西南宁 530021）

胎盘植入性疾病是指滋养层细胞不同程度地侵袭子宫肌层。PAS 患者往往面临剖宫产术中或术后大出血，从而导致孕产妇凝血功能障碍甚至死亡。故PAS 患者不仅需输注大量血液制品，还增加切除子宫的风险[1]。

妊娠期免疫耐受有助于促进人类妊娠成功[2]，而CD200-CD200R1 信号通路具有强大的免疫抑制功能[3]。我们推测CD200R1 在促进PAS 的形成中起着免疫系统失调、EVT 过度侵袭的作用。在此，我们充分利用计算生物学方法的优势以协助PAS 研究，通过收集PAS 及相应的对照组织样本，并利用信使核糖核酸测序技术，比较PAS 组与非PAS 组之间的CD200R1 表达模式。然后，我们整合全球范围内所有PAS 测序数据，对CD200R1 在PAS 中的表达进行综合评估。我们通过对PAS 中CD200R1 共表达基因的富集分析，进一步研究CD200R1 在PAS 中的潜在作用和机制。

1 材料和方法

1.1 本课题组mRNA- seq

1.1.1 研究对象。本院伦理委员会（2015KY-E-042）同意本研究实施，并获得全部参与者的知情同意书。本研究纳入2016年1 月1 日至2017 年9 月30 日在本院住院分娩的PAS 患者，选取因疤痕子宫而行剖宫产分娩的患者为对照组。最终，收集到3 例穿透型胎盘植入（PAS 组）患者和5 例对照组的胎盘标本。无肌层和浆膜层的PAS 胎盘标本从胎盘侵袭最深的部位取得，而对照组胎盘标本从胎盘的母体表面获取。所有胎盘标本的mRNA-seq 采用双端测序，在BGISEQ-500 测序平台上读取100 碱基对（bp）的成对读段（reads），每个胎盘样本获得存放read1和read2 的2 份fastq 测序文件，由华大基因（BGI）完成。

1.1.2mRNA-seq 数据分析。利用FastQC 软件对本课题组的mRNA-seq 进行质量控制，通过STAR 软件将测序文件与人类参考基因GRCh38 进行比对获得表达矩阵，并对表达矩阵进行log2X 转换。差异表达基因分析由R 语言limma 包完成。ggplot2和pROC 包对CD200R1 mRNA 表达数据绘制箱式图和受试者工作特征（ROC）曲线。

1.2 公共数据库的PAS 测序数据

从序列片段归档数据库（SRA）、基因表达综合数据库（GEO）、生物项目数据库（BioProject）和ArrayExpress 公共数据库中下载全部人类PAS 的CD200R1 mRNA 表达数据。筛选后纳入两个PAS测序数据（GSE136048、PRJNA627183），见表1。

表1 纳入的公共数据集的特征

1.3CD200R1 在PAS 中潜在的分子机制

在3 个测序数据中获取|皮尔逊相关系数|＞0.30 和P＜0.05 的CD200R1 共表达基因。正相关基因被认为是本课题组mRNA-seq 高表达基因中的CD200R1 正相关基因；而负相关基因被认为是本课题组mRNA-seq 低表达基因中CD200R1 负相关基因。clusterProfiler 包用于完成功能（GO）和通路（KEGG）富集分析。Cytoscape 软件构建蛋白质相互作用网络（PPI），并利用cytoHubba 算法获取degree排名前5 的枢纽（hub）基因。

1.4 统计与分析

Stata14.0 软件对整合后的CD200R1 mRNA 数据进行标准化均数差（SMD）和95%置信区间（CI）分析、Egger's 检验和敏感性分析。PAS 患者与对照组之间CD200R1 表达差异显著性由Student’s t 检验进行，P＜0.05 被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 本课题组mRNA- seq 的差异表达分析

满足Fold Change＞1.2 或＜-0.8 且P＜0.05 的基因被选为PAS 中的差异表达基因，火山图（图1A）用来可视化差异分析的结果。CD200R1 在PAS组比对照组明显增高见图1B（P=0.0276），CD200R1对PAS 组和对照组有较好的区分能力（ROC 曲线下面积AUC=1.00，图1C）。

图1基因的火山图（A）CD200R1 的表达（B）ROC 曲线（C）

2.2CD200R1 在PAS 中的综合表达

我们通过充分整合3 个数据集，包括1 个微阵列（GSE136048） 和2 个RNA-seq 数 据（PRJNA627183 和本课题组mRNA-seq 数据），进一步检测CD200R1 在PAS 中的综合表达，共14 例PAS样本和13 例非PAS 样本。与非PAS 组相比，PAS 组的CD200R1 表达明显升高（SMD=0.861，95%CI=0.003-1.719，图2A）。基于Egger’s 检验的漏斗图显示各数据集之间无异质性（P= 0.154，图2B）。敏感性分析提示合并的SMD 结果稳定（图2C）。

图2 分别展示了森林图（A） Egger’s 检验（B） 敏感性分析（C）

2.3CD200R1 共表达差异基因的富集分析

经过取交集后，获得CD200R1 正相关基因382个，CD200R1 负相关基因390 个。负相关基因参与细胞-基板连接组件、细胞-底物连接、细胞黏附分子结合（cell-substrate junction assembly、cell-substrate junction、cell adhesion molecule binding）等功能（图3A），正相关基因涉及血小板激活、早期核内体、IgG 结 合（platelet activation、early endosome、IgG binding）等通路（图3C）。负相关基因参与精氨酸和脯氨酸代谢，脂肪酸延长（arginine and proline metabolism、fatty acid elongation）等功能（图3B），正相关基因涉及精氨酸和脯氨酸代谢、脂肪酸降解（arginine and proH2BC5（图4A），在本课题组mRNA 测序数据中均低表达见图4B（P＜0.05）。正相关基 因PPI 中 的hub 基 因 为：TLR4、CD86、PLEK、FCGR1A、FCGR2A（图4C），在本课题组mRNA 测序数据中均高表达见图4D（P＜0.05）。

图3 CD200R1 共表达基因GO 及KEGG 富集

图4 CD200R1 共表达基因PPI 及hub 基因的表达

3 讨论

分析表明，CD200R1 可能通过细胞- 基板连接组件、血小板激活、精氨酸和脯氨酸代谢有助于PAS 的发生发展。这些研究结果表明CD200R1 是PAS 的关键基因。本研究通过整合所有PAS 测序数据，增加了样本量，提高结果的准确性。同时作为一项多中心研究，我们首次揭示了CD200R1 在PAS 中的高水平表达。

子痫前期（PE）、流产和早产被认为是滋养细胞侵袭能力不足的疾病[4]，与PAS 中滋养细胞过度侵袭不同。因此，我们可以将PAS 与PE、早产、流产联系起来，以更好地理解CD200R1 在PAS 中发挥的作用，从而进一步证明CD200R1 在PAS 致病中存在重要意义。我们推测CD200R1 的上调可能通过细胞-基板连接组件、血小板激活、精氨酸和脯氨酸代谢通路等途径促进滋养细胞的迁移和侵袭，诱导血管生成，进而促进PAS 的发生发展。CD200R1 共表达基因中hub 基因对预测PAS 的发病机制同样重要。FN1 对滋养层侵袭、细胞黏附、生长、迁移和分化中发挥关键作用，与子宫平滑肌瘤及子痫前期发生发展有关[5]。同时，异常表达的TLR4 与免疫系统异常反应、滋养细胞浸润不足和螺旋动脉重构有关。以上提示hub 基因参与滋养层侵袭、细胞黏附、免疫反应等过程，进一步提示CD200R1 同样有类似的功能，从而促进PAS 的发生。

本研究的关键优势在于首次利用计算生物学方法整合PAS 在全球范围内的表达数据，验证CD200R1在PAS 中的高表达，并进一步探索CD200R1 在PAS中的潜在机制。我们未来的目标是通过体外和体内实验证实CD200R1 在PAS 中的作用。