气相色谱法测定食品中的氯化苦

2022-02-24单婷婷张敬波

分析仪器 2022年1期

单婷婷张敬波

(大连市检验检测认证技术服务中心，大连 116021)

1 前言

氯化苦(三氯硝基甲烷，英文名Chloropicrin)作为我国应用较久的粮仓熏蒸剂，主要用于杀灭粮食中的害虫，氯化苦对粮食有破坏作用，大量使用会在粮食中残留。我国现行标准检测方法为比色法[1]，但该方法灵敏度低，重现性差，介质背景干扰大。对氯化苦残留量的测定文献报道主要采用酸回流、石油醚和无水乙醇方法[2-4]，酸回流方法提取样品中的氯化苦操作繁琐，石油醚提取样品中的氯化苦损耗大、且对人员健康和环境有一定的危害，而无水乙醇直接提取粮食中的氯化苦对色谱柱污染严重，重现性差。顶空-气相色谱法[5,6]需自动顶空进样器，有些实验室不具备检测条件，手动进样误差较大。本实验采用无水乙醇提取，提取液经净化后用正己烷反萃，气相色谱法测定，降低了食品基质对色谱柱的污染，方法简单、快捷、灵敏度高、重现性好。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

Agilent6890N气相色谱仪，配电子捕获检测器和自动进样器。

氯化苦标准物质(100 mg/L)；乙醇和正己烷(色谱纯)；氯化钠 (分析纯，使用前550 ℃灼烧4 h)，使用前将氯化钠配制成饱和溶液；实验用水为超纯水；PSA固相萃取填料(粒径40～63 μm)，C18固相萃取填料(粒径50 μm)；大米、小麦、大豆油(市售)。

2.2 色谱条件

色谱柱：DB-5弹性石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×1.5 μm)；载气：高纯氮，流量：1.5 mL/min，恒流模式；补偿气：氮气，流量：60 mL/min；检测器温度：300 ℃；进样口温度：170 ℃；不分流；进样量：1 μL；柱温升温程序：初始温度50 ℃，以8 ℃/min的速率升至120 ℃，再以30 ℃/min的速率升至280 ℃，保持2 min。

2.3 样品测定

称取原粮样品5.00 g于40 mL具塞聚丙烯离心管中，加入10 mL乙醇超声30min，-18 ℃下冷冻30 min后以4000 r/min的速率离心1 min，取上清液2 mL加入预装有80 mg PSA和80 mg C18的10 mL具塞玻璃离心管中，涡旋30 s后以4000 r/min的速率离心1 min，取净化液1 mL，加入2 mL饱和氯化钠溶液和2 mL正己烷，涡旋30 s后以4000 r/min的速率离心1 min，取正己烷层用于气相色谱测定。

称取大豆油样品5.00 g于40 mL具塞聚丙烯离心管中，加入20 mL乙醇剧烈摇振1 min，-18 ℃下冷冻30 min后以4000 r/min的速率离心1 min，取上清液2 mL加入预装有80 mg PSA和80 mg C18的10 mL具塞玻璃离心管中，涡旋30 s后以4000 r/min的速率离心1 min，取净化液1 mL，加入2 mL饱和氯化钠溶液和2 mL正己烷涡旋离心，取正己烷层用于气相色谱测定。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

氯化苦的沸点较低，在常规毛细管色谱柱上保留时间较短，溶剂峰会影响其峰形且不易和干扰峰分离。对长度为30m的不同内径、固定相和膜厚的常用色谱柱如：DB-1、DB-5、DB-624、DB-225等色谱柱进行了比较，发现当这几种固定相膜厚超过1.00 μm时氯化苦均能和杂质峰有效分离。其中DB-624和DB-225的固定相均含有极性基团，最高使用温度较低，高温时柱流失会增大使基线变高；DB-1和DB-5色谱柱的使用温度高，固定相不易流失，考虑到氯化苦有一定的极性，采用极性稍的DB-5能得到更好的峰形，所以确定采用DB-5色谱柱。

考察了溶剂对氯化苦峰形的影响。分别用正己烷、甲醇和乙醇将氯化苦配制成浓度为0.01 μg/mL的标准溶液进行测定，发现相同的色谱条件下，用正己烷作溶剂时氯化苦的峰形明显优于甲醇和乙醇(图1)。

图1 0.01 μg/mL的不同溶剂的氯化苦标准溶液的色谱图

对气相色谱进样口温度进行了优化。发现当进样口温度高于190 ℃时氯化苦的响应明显下降，温度越高响应越低。当进样口温度升至250 ℃时0.01 μg/mL的标准工作溶液面积比180 ℃时降低了约60 %，为了保证气化效率，将进样口温度设为170 ℃。

3.2 提取溶剂的选择

常见的有机溶剂对氯化苦中均有较好的溶解能力。丙酮、乙酸乙酯、烷烃等对油脂的溶解性太强，若用作提取剂会将样品中的脂肪溶出且很难除去。醇类溶剂对脂肪溶解力较弱且与粮谷基质亲和力好。分别用甲醇、乙醇和异丙醇对添加了氯化苦的空白粮谷样品进行提取实验，当样品质量和溶剂体积比为2∶1时甲醇回收率为60%左右，乙醇和异丙醇回收率在80%以上。甲醇具有较高的毒性，对检验人员健康和环境有较大的危害，异丙醇会溶解较多脂肪且和正己烷的互溶性好，不利于进一步净化和正己烷萃取，乙醇无毒且回收率好，因此选择乙醇为提取溶剂。

分别用乙醇以1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的比例对添加氯化苦的粮谷和大豆油样品进行提取，当粮谷样品质量和溶剂体积比为1∶2时，大豆油在1∶4时回收率满意，能达到80%以上。

3.3 净化和反萃条件的优化

粮谷样品中的脂肪、游离脂肪酸和色素等脂溶性物质和少量淀粉会随氯化苦进入乙醇提取液，若直接进行测定，这些物质会在进样口和色谱柱柱头积累，影响仪器灵敏度和平行性，缩短色谱柱使用寿命。低温时脂肪在乙醇中的溶解度低，冷冻后再离心可初步减少乙醇提取液中的脂肪含量。粮谷中农残测定时可用PSA固相萃取填料加入提取溶液的方式去除游离脂肪酸和部分色素，用C18除去部分脂肪[7]。以添加量0.1 mg/kg的大豆油为研究对象考察了C18的用量对除脂效果和回收率的影响，采用酯交换法对待测正己烷溶液进行甲酯化[8]，以油酸甲酯峰面积的变化衡量除脂效果(平行测定3次)。当乙醇提取液体积为2 mL时，以C18的加入量为横坐标，油酸甲酯面积百分比和回收率为纵坐标作趋势图(见图2)。结果表明：随着C18的量的增加油酸甲酯峰面积明显减少，当C18的量超过50 mg后油酸甲酯的峰面积减少趋势变缓，当C18的量大于100 mg时油酸甲酯的峰面积不再有明显变化且回收率略有降低，选择C18加入量为80 mg。

图2 油酸甲酯、回收率和C18加入量的关系图

净化后的乙醇提取液加入饱和氯化钠溶液后用正己烷进行反萃，淀粉等水溶性物质滞留于水层，氯化钠的盐析作用促使目标物进入正己烷。以不同体积比的乙醇、饱和氯化钠溶液、正己烷进行萃取实验，考查反萃溶液比例对回收率的影响，结果显示，以乙醇、氯化钠饱和溶液、正己烷体积比为1∶2∶2时，提取1次后水相中基本无氯化苦残留。

3.4 标准曲线

用丙酮将氯化苦标准溶液稀释成10 μg/mL的标准使用液，再用正己烷作溶剂，配制成0.0010、0.0025、0.0050、0.0125、0.0250、0.1000、0.5000、1.0000 μg/mL的标准工作溶液系列，按2.2的仪器条件测定。以氯化苦的浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。氯化苦在 0.0010～1.0000 μg/mL范围内线性良好，其回归方程为y=361945.70x-3160.27，线性相关系数(r)为0.99893。

3.5 方法回收率和最低定量限

分别对大米、小麦、大豆、玉米、大豆油空白样品进行添加回收实验，添加水平为0.01 mg/kg、0.05mg/kg和0.5 mg/kg，每个水平平行测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)。结果表明：样品中氯化苦平均回收率在74.9 %～98.9 %之间，相对标准偏差(RSD)在0.5 %～3.2 %之间，具体数据见表1。添加浓度为0.01 mg/kg时信噪比大于10，可视为最低定量限。