腐殖酸单侧刺激对玉米根系生长的影响

周丽平，袁亮，赵秉强✉，李燕婷

1天津市农业科学院农业资源与环境研究所，天津 300384；2中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081

0 引言

【研究意义】腐殖酸作为一种天然增效材料，是一类结构复杂、功能多样的天然高分子混合物。它能够通过调控肥料的释放、转化和供应，提高肥料利用率，协调作物高产与肥料资源和环境保护绿色发展的矛盾，此外，腐殖酸不仅能调控肥料本身以改善肥效，也能促进根系生长吸收而提高肥料利用率，绿色高效肥料新产品只有更好地调控和促进根系的吸收功能，才能大幅度提高肥料利用率[1-3]。【前人研究进展】腐殖酸具有“改良土壤，增效肥料，刺激生长，增强抗逆，改善品质”等五大功能，因其具有较高的物理、化学和生物活性，它可促进作物养分吸收，并提高土壤中养分的含量，以综合调控植物生长环境，改善植物体的养分吸收、同化和利用状况。ROSE等[4]采用Meta分析方法研究了 390种腐殖质对植物生长的影响，结果发现，施用腐殖酸后，植物地上部生物量增加224%，根干重增加216%，腐殖酸对植物生长的促进效果因腐殖酸的来源、浓度、植物生长环境、植物类型和腐殖酸的施用方式而异。MUSCOLO等[5]综述了腐殖物质与植物生长发育之间的关系，结果发现，腐殖酸对植物生长的影响取决于腐殖质组分的来源、浓度和分子量，并且主要取决于其中所含的化合物种类。此外，腐殖酸还可以通过促进与信号转导、激素代谢、转录、蛋白质代谢、转运、防御和生长相关的基因的上调，从而促进作物的生长发育[6]。将玉米幼苗浸入不同浓度的腐殖酸溶液中，腐殖酸的施用显著增加了根尖中边缘细胞的释放，并呈现出钟形的剂量反应曲线[7]。腐殖酸尿素处理可增加根系的干重，促进不定根到贮藏根的分化，并增加了整体根系活性、总根长、根直径、根表面积和根体积，同时也增加了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，并增加了根的可溶性蛋白质含量，降低了丙二醛（MDA）含量，也可通过生物产量和收获指数的协同增加而增加产量[8]。【本研究切入点】前人关于腐殖酸对作物根系生长调控的研究多集中于不同来源、添加量、分子量、官能团结构的腐殖酸作用于整株作物，对于腐殖酸单侧刺激对作物根系生长调控的研究未有报道。【拟解决的关键问题】腐殖酸可促进植物体的生长发育，但其作用效果到底是直接效应还是间接效应未有报道，本研究以玉米郑单958为供试作物，以研究腐殖酸单侧刺激对玉米根系生长的影响，以明确腐殖酸对玉米根系生长的直接效应和间接效应，从而为风化煤腐殖酸影响玉米根系生长发育的机理研究提供借鉴，并为风化煤腐殖酸的优化利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试夏玉米品种为郑单958（Zea may L.），供试风化煤来自内蒙古棋盘井煤矿（东经107°12'E，北纬39°21'N，内蒙古自治区鄂尔多斯市），腐殖酸（HA）是采用 IHSS标准方法从风化煤中提取[9]，提取率为50.40%。供试腐殖酸的碳、氢、氧和氮含量分别为47.00%、4.89%、1.04%和 33.56%。供试氧化腐殖酸OHA3和 OHA6是采用过氧化氢氧化方法制备而得（是根据玉米根系效应试验从 9种氧化腐殖酸OHA1—OHA9中挑选而得，OHA3和OHA6分别是对玉米根系作用效果最差和最优的氧化后腐殖酸），OHA3的制备条件如下：双氧水浓度为5%，液固比为1.5∶1，反应时间为5 h，温度为80℃。OHA6的制备条件如下：双氧水浓度为10%。液固比为1.5∶1；反应时间为1 h；温度为60℃[10]。

1.2 试验设计

该试验于2019年1月在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所人工气候室进行，白天温度为28℃，夜间温度为20℃，盆栽所用基质为石英砂，直径约2 mm的石英砂先用8 %的稀盐酸浸泡24 h后，用自来水及去离子水清洗干净，经高温高压灭菌 30 min后使用，使用HA腐殖酸（HA）、OHA3腐殖酸（OHA3）和OHA6腐殖酸（OHA6）开展试验，采用分根试验设计，每种腐殖酸分为施用侧和未施侧，加上对照处理（CK）后，试验处理分别设置为CK-左对照侧（CK-C1）、CK-右对照侧（CK-C2）、HA-未施侧（HA-C）、HA-施用侧（HA-T）、OHA3-未施侧（OHA3-C）、OHA3-施用侧（OHA3-T）、OHA6-未施侧（OHA6-C）和OHA6-施用侧（OHA6-T）。

试验装置为 PVC 塑料板与有机玻璃板拼接而成（图1）。中间用PVC 塑料板隔成两室，正面为透明有机玻璃板，根室内装有直径约2 mm石英砂，在有机玻璃板与石英砂之间用400目尼龙网隔开，植物种植于有机玻璃板与尼龙网之间，不与石英砂直接接触，有利于观测及试验处理和收获。由于本试验采用根系分隔方法，玉米移苗时，先将主胚根去除，选择种子根为4条且长势均匀的玉米植株，将根系均匀分为两组装入两室根盒中，生长20 d后收获。

采用霍格兰营养液进行培养，所用霍格兰营养液的配方为 Ca(NO3)2·4H2O 1.18 g·L-1、KNO30.51 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.49 g·L-1、KH2PO40.14 g·L-1、EDTA-Fe 0.036 g·L-1、H3BO32.86 mg·L-1、MnCl2·4H2O 1.81 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.08 mg·L-1、H2MoO4·4H2O 0.09 mg·L-1[11]。每天每侧浇灌50 mL营养液，保证养分的及时供应，施用侧的腐殖酸添加量为 10 mg C·L-1。

玉米种子经70%的酒精表面消毒10 min，用蒸馏水洗净后，在蒸馏水中浸泡24 h，转移至石英砂中，在25℃下遮光环境中萌发3 d，出苗后移入生长室。两叶一心时，精选出苗整齐的幼苗，去掉胚乳后移入盆钵中缓苗，每盆一株。缓苗营养液 pH为 6.0±0.5（用 1 mol·L-1的 NaOH 溶液和 1 mol·L-1的HCl溶液调节营养液pH），2 d后换成完全营养液，每隔一天更换一次营养液。试验设6次重复，随机区组排列。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生物量测定 移苗20 d后，将玉米植株分为根、茎和叶，称量其鲜重，蒸馏水清洗后，于105 ℃下杀青30 min，65 ℃下烘干至恒重、称重。

1.3.2 根系活力测定 移苗20 d后，采集植株根系，蒸馏水洗净后，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法测定根系活力[12]，根系 TTC还原总量为根鲜重与TTC还原强度的乘积。

1.3.3 根系形态指标测定 移苗20 d后，截取植株根系，蒸馏水洗净后，利用平板扫描仪扫描（扫描仪设置：专业模式、胶片（带导轨）、8位灰度、400 dpi、黑白正片、保存格式.tif格式）得到根系扫描图片，图片利用 WinRhizo根系分析软件处理分析，获得玉米根系形态指标（总根长、根体积、根表面积和根平均直径），并测定轴根长（主根长）和轴根数（主根数），计算出总侧根长和侧根密度。

1.3.4 植株不同部位红外光谱分析 将烘干的玉米植株根和地上部磨碎后过0.2 mm筛，分别称取1 mg样品与200 mg溴化钾（KBr），放入玛瑙研钵中研磨均匀后进行压片，采用傅里叶变换红外光谱仪（型号：VERTEX 70，德国Bruker公司）检测玉米植株根、茎和叶的光谱特征（波数范围为400—4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次），以测定玉米根系和地上部的主要化学组分。

所有处理的玉米根系（图2）和地上部（图3）均具有相似的主要红外光谱吸收峰，主要有（1）3 420 cm-1：-OH的伸缩振动和-NH的伸缩振动，主要来自糖类等碳水化合物[13]；（2）2 920 cm-1：主要来自脂类物质中饱和甲基C-H伸缩振动[14-16]；（3）1 750—1 500 cm-1：主要来自蛋白质、多肽、氨基酸类物质C=O伸缩振动、N-H弯曲振动[17-18]；（4）1 380 cm-1：蛋白质甲基弯曲振动[18-19]；（5）1 250 cm-1：核酸中 P=O伸缩振动[19-20]；（6）1 050 cm-1：糖类C-O-C伸缩振动，糖类在植物体内主要以纤维素、多糖等存在于细胞壁中[19-21]。

图2 分根单侧施用腐殖酸处理的玉米根系FTIR光谱图Fig.2 FTIR spectra of maize roots with local stimulation of humic acids

图3 分根单侧施用腐殖酸处理的玉米地上部FTIR光谱图Fig.3 FTIR spectra of maize shoots with local stimulation of humic acids

1.4 数据处理与分析

试验数据采用 Excel 2003和Origin 9.0软件对数据进行处理和作图，采用 SAS 9.1统计软件 Duncan方法进行方差分析。

2 结果

2.1 分根单侧施用腐殖酸对玉米根重量的影响

分根单侧施用腐殖酸能够提高玉米施用侧和未施侧的根鲜重（表 1），与对照相比，施用侧提高21.9%—78.6%，未施侧提高 27.9%—49.3%，分根单侧施用腐殖酸可提高玉米施用侧和未施侧的根干重（表1），与对照相比，施用侧提高34.7%—96.4%，未施侧提高14.8%—41.7%。各处理间的增重规律与根鲜重类似。这说明腐殖酸对根系调控具有“直接”效应，另外，单侧施用腐殖酸处理的整株根系的根鲜重和根干重显著大于两侧均未施腐殖酸的对照处理，说明了腐殖酸调控根系生长也具有“间接”效应。当进一步探究分根单侧施用腐殖酸对玉米地上部生长的影响时（表1），OHA6的地上部增重最多，这表明，分根单侧施用腐殖酸时，腐殖酸可能会通过影响玉米地上部物质的调控，来影响另一侧的根系生长。

表1 分根单侧施用腐殖酸对玉米生物量的影响Table 1 Effect of local stimulation of humic acids on maize weight

2.2 分根单侧施用腐殖酸对玉米根系活力的影响

添加腐殖酸能够增加玉米施用侧和未施侧的根系活力和TTC还原总量（表2），与对照相比，OHA6-施用侧处理的玉米根系活力和根系 TTC还原总量提高幅度最大，分别提高76.9%和216.9%，HA-施用侧和OHA3-施用侧处理与对照相比，玉米根系活力分别提高59.8%和35.1%，玉米根系TTC还原总量分别提高 144.1%和 73.0%，OHA6-未施侧、HA-未施侧和OHA3-未施侧处理与对照相比，玉米根系活力分别提高62.2%、53.6%和25.5%，玉米根系TTC还原总量分别提高89.8%、128.4%和60.4%。总之，与分根单侧施用腐殖酸对玉米根重量的影响类似，腐殖酸对玉米根系的生长既存在局部效应，也存在整体效应。

表2 分根单侧施用腐殖酸对玉米根系活力的影响Table 2 Effect of local stimulation of humic acids on maize root activity

2.3 分根单侧施用腐殖酸对玉米根系形态的影响

2.3.1 根体积、根表面积、根平均直径 添加腐殖酸处理能够增加玉米未施侧和施用侧的根体积、根表面积和根平均直径（表3）。与对照相比，HA-施用侧、OHA3-施用侧和 OHA6-施用侧的根体积分别提高65.8%、27.6%和81.3%，HA-未施侧、OHA3-未施侧和 OHA6-未施侧的根体积分别提高 52.5%、10.7%和46.0%。与对照比较，HA、OHA3 和OHA6处理下，整株玉米的根体积分别提高56.2%、36.3%和71.8%。与对照对比，HA-施用侧、OHA3-施用侧和OHA6-施用侧的根表面积分别提高36.5%、10.0%和51.9%，HA-未施侧、OHA3-未施侧和OHA6-未施侧的根表面积分别提高10.2%、6.5%和30.7%。与对照相比，HA、OHA3和 OHA6处理下，整株玉米的根表面积分别提高23.5%、8.3%和 41.5%。与对照比较，HA-施用侧、OHA3-施用侧和 OHA6-施用侧的根平均直径分别提高8.0%、7.8%和30.8%，HA-未施侧、OHA3-未施侧和OHA6-未施侧的根表面积分别提高13.7%、0.8%和9.2%。与对照对比，HA、OHA3 和OHA6处理下，整株玉米的根平均直径分别提高 10.8%、4.4%和20.2%。

表3 分根单侧施用腐殖酸对玉米根体积、根表面积和根平均直径的影响Table 3 Effect of local stimulation of humic acids on maize root volume,root surface area and average root diameter

2.3.2 根长度 添加腐殖酸能够增加玉米根系施用侧和未施侧的总根长度、主根长度和侧根长度（表4）。OHA6-施用侧的总根长度、主根长度和侧根长度最长。就总根长和侧根长而言，各处理的大小顺序依次为 OHA6-施用侧＞HA-施用侧＞OHA6-未施侧＞HA-未施侧＞OHA3-施用侧＞CK处理。各处理的玉米主根长的大小顺序依次为 OHA6-施用侧＞HA-施用侧＞HA-未施侧＞OHA6-未施侧＞OHA3-施用侧＞CK处理。与对照相比，HA-施用侧、OHA3-施用侧和 OHA6-施用侧的玉米总根长分别提高67.9%、44.2%和90.7%，HA-未施侧、OHA3-未施侧和OHA6-未施侧处理的玉米总根长分别提高44.3%、28.3%和52.7%。

表4 分根单侧施用腐殖酸对玉米根长度的影响Table 4 Effect of local stimulation of humic acids on maize root length

2.3.3 根数量 添加腐殖酸能够增加玉米根系施用侧和未施侧的总根数和侧根数（表 5），对主根数的影响大小不一。OHA6-施用侧的总根数、主根数和侧根数最长。就总根数和侧根数而言，各处理的大小顺序依次为 OHA6-施用侧＞HA-施用侧＞OHA6-未施侧＞HA-未施侧＞OHA3-施用侧＞CK处理。HA-施用侧、OHA6-施用侧和 OHA6-未施侧的主根数较对照有所增加，其他处理与对照主根数相同或有所降低。与对照相比，HA-施用侧、OHA3-施用侧和 OHA6-施用侧的玉米总根数分别提高58.4%、40.5%和71.6%，HA-未施侧、OHA3-未施侧和OHA6-未施侧处理的玉米总根数分别提高37.9%、25.8%和49.7%。

表5 分根单侧施用腐殖酸对玉米根数量的影响Table 5 Effect of local stimulation of humic acids on number of maize root

2.4 分根单侧施用腐殖酸对玉米各器官主要化学组分的影响

2.4.1 对玉米根部主要化学组分的影响 与空白对照相比，添加腐殖酸处理的施用侧和未施侧玉米根系红外光谱在 2 920、1 735、1 518、1 380和 1 250 cm-1波数附近的透射率明显低于对照，这说明，分根单侧施用腐殖酸可有效增加玉米根系酯类化合物、蛋白质、氨基酸类物质、核酸纤维素和多糖的含量（图2，表6）。各处理之间的未施侧和施用侧相比，OHA6处理的施用侧有利于玉米根系碳水化合物的积累，OHA6-未施侧玉米根系蛋白、多肽、氨基酸和核酸积累较多。HA-施用侧玉米根系的碳水化合物、蛋白质、多肽、氨基酸、纤维素和多糖含量高于HA-未施侧，HA-未施侧玉米根系的酯类化合物和核酸含量高于 HA-施用侧。OHA3-施用侧玉米根系的碳水化合物含量明显高于 OHA3-未施侧，OHA3-未施侧玉米根系的酯类化合物和核酸含量较高。总之，腐殖酸的施用侧较未施侧相比，更有利于玉米根系碳水化合物的积累，而腐殖酸的未施侧更有利于玉米根系核酸的积累。

表6 分根单侧施用腐殖酸处理的玉米根特征峰对应透射率表Table 6 The transmittance peaks of the maize roots with local stimulation of humic acids

2.4.2 对玉米地上部主要化学组分的影响 各腐殖酸处理的玉米施用侧和未施侧地上部碳水化合物的含量明显高于对照处理（图3，表7）。OHA6-施用侧的玉米地上部酯类化合物、蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、纤维素和多糖的含量高于OHA6-未施侧，OHA6-未施侧的玉米地上部碳水化合物含量高于OHA6-施用侧。OHA3-施用侧玉米地上部纤维素和多糖含量明显高于 OHA3-未施侧。HA-施用侧的碳水化合物和蛋白质含量明显高于HA-未施侧。

表7 分根单侧施用腐殖酸处理的玉米地上部特征峰对应透射率表Table 7 The transmittance peaks of the maize shoots with local stimulation of humic acids

3 讨论

3.1 腐殖酸对作物根系生长的调控效应

腐殖酸含有丰富的羧基和羟基等含氧活性官能团、多种营养元素和有益成分，具有酸性、亲水性、界面活性、阳离子交换能力、络合能力和吸附能力[22-27]。在植物体尤其是根系的生长发育过程中具有较好的调控效应，前人的研究结果表明，添加腐殖酸后，番茄的根数量和根长度均显著增加，这可能与腐殖酸的类生长素作用有关，从而改变细胞质膜的通透性，通过促进细胞的生长来促进番茄根系的生长发育[28]，这与本研究的结果类似。与不添加腐殖酸相比，所有的腐殖酸处理均可以提高玉米根系的生物量和根系活力，并改善根系形态，对于玉米根系的生长具有较好的调节作用，这可能与腐殖酸可以诱导根毛的发生有关[7]。CANELLAS等[29]研究了腐殖酸的结构性与侧根出现的生物活性之间的关系，结果发现，侧根的出现主要与NMR参数有关，其中低疏水性（HB）碳含量的腐殖酸，更有利于诱导侧根毛。HERDER等[30]报道了腐殖质直接影响根系结构和养分吸收，提高了植物产量，这也解释了本研究的结果。

3.2 腐殖酸调节作物生长发育的直接效应和间接效应

当单侧刺激玉米根系时，各腐殖酸施用侧的玉米根鲜重、根干重、根系活力和根系TTC还原总量较对照处理均有提高，两侧的玉米根体积、根表面积、根平均直径、根长度和根数量也有所提高，这说明，腐殖酸对玉米根系生长的促进作用是直接效应。此外，与两侧均添加腐殖酸的处理相比，添加腐殖酸的未施侧的根系生物量和活性也有提高，这表明，腐殖酸对玉米根系生长也存在间接效应或整体效应。直接接触到腐殖酸的一侧根系好于另一侧根系，说明了腐殖酸的直接效应大于间接效应。腐殖酸对玉米根系生长的调控既存在“局部”效应，也存在“整体”效应，这可能取决于三个原因。第一，分根单侧施用腐殖酸时，起到信号传导作用，使另一侧也有较好的响应；第二，分根单侧施用腐殖酸时，会整体改善玉米根系的原生代谢和次生代谢过程，从而调控了玉米植株整体的生长发育，从而引起未刺激侧玉米根系的生长；第三，分根单侧施用腐殖酸时，可调控玉米地上部的代谢过程，从而作用于未使用腐殖酸的一侧，以促进分根两侧根系的生长。对于分根单侧施用腐殖酸对玉米根系的具体调控机制，还需进一步开展相关试验进行验证。

4 结论

分根单侧施用腐殖酸可增加玉米根鲜重、根干重、根系活力和根系TTC还原总量，且腐殖酸施用侧的作用效果优于未施侧，同时，分根单侧施用腐殖酸也可有效增加玉米根系酯类化合物、蛋白质、氨基酸类物质、核酸、纤维素和多糖的含量，且施用侧更有利于玉米根系碳水化合物的积累，未施侧更有利于玉米根系核酸的积累。此外，单侧施用腐殖酸处理的整株根系生长也优于两侧均未施腐殖酸的处理。总之，腐殖酸对玉米根系生长既存在直接效应又存在间接效应，且直接效应大于间接效应。