黄蒲通窍胶囊对阿尔茨海默病模型大鼠Wnt/Ca2+信号通路的影响

刘 娟，叶 树，谢道俊，王 艳，3，蔡 标，3，4

(1.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；3.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；4.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，安徽 合肥 230012；)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿，进行性发展的神经系统退行性疾病，其主要病理特征是脑内淀粉样斑块沉积和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及广泛的海马神经细胞缺失[1]。Tau蛋白是一种正常未折叠的、可溶性较高的微管相关蛋白，在微管的组装和稳定中起着至关重要的作用，可自然调节微管稳定性、信号通路和轴向传输[2-3]，从而发挥神经细胞的正常功能，AD病变时Tau过度磷酸化，Tau单体转化为Tau低聚物诱导Tau聚集为成对螺旋丝，导致NFTs的形成[4]。NFTs积聚在神经细胞胞质、轴突和树突中，因此Tau在AD病变的发生、发展中起着关键作用[2，5]。

中医学认为，AD属“痴呆”范畴，其病机为年迈体虚、脑髓失养、痰浊血瘀、痹阻脑络导致蒙蔽清窍、神机失用，益气补肾、豁痰化瘀为其根本治疗大法[6]。近年来研究[7]显示，中医药以多靶点作用机制防治AD具有明显的价值与优势，因此从中药复方中筛选有效抗AD药物具有显著意义。黄蒲通窍胶囊作为安徽中医药大学第一附属医院用于治疗AD的制剂，主要由大黄、石菖蒲、人参、川芎、制何首乌、益智仁6味中药组成，功能益气补肾、豁痰化瘀。本课题组前期研究发现，黄蒲通窍胶囊通过调控钙调蛋白(calmodulin，CaM)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅳ，CaMKⅣ)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)-磷脂酶Cγ(phospholipase Cγ，PLCγ)等通路，减少神经细胞损伤，抑制Tau蛋白过度磷酸化，改善AD模型大鼠学习记忆的能力[8-10]。

为了进一步阐明黄蒲通窍胶囊治疗AD的作用机制，本实验采用腹腔注射D-半乳糖联合双侧海马注射Aβ25-35建立AD大鼠模型。黄蒲通窍胶囊干预后，观察其对Wnt/Ca2+通路的调控作用，进一步探讨黄蒲通窍胶囊治疗AD的机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 老龄SD健康雄性大鼠40只，体质量250～350 g，购自南京青龙山动物中心，动物生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0003。本实验获得安徽中医药大学实验动物中心的批准。

1.2 药物 黄蒲通窍胶囊(石菖蒲、益智仁、川芎、制何首乌各20 g，人参10 g，大黄6 g，取其水煎剂放入4 ℃冰箱保存备用，批准文号为皖药制字 Z20080006，批号 20160907)：安徽中医药大学第一附属医院药剂科制备；Aβ25-35(批号 A4559-1MG)：Sigma公司；D-半乳糖：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试剂及仪器 Aβ25-35试剂：Sigma公司，使用前用无菌生理盐水配成2 mg/mL溶液，在37 ℃恒温孵育7 d，使其变成凝聚态；Wnt5兔抗大、小鼠抗体和Frizzled兔抗大、小鼠抗体：Affinity公司；PLCβ兔抗大、小鼠抗体：Novus Biologicals USA；BCA试剂盒：碧云天生物技术有限公司；GAPDH抗体：Abbkine公司。脑立体定位仪：Stoelting；酶标仪(Multiskan MK2型)：印度Labsystem；微量注射泵(RWD-202)：瑞沃德公司；RM2016病理切片机：徕卡仪器有限公司；高速冷冻离心机：Thermo Scientific公司；光学显微镜(Nikon Eclipse E100)：日本尼康；FCM凝胶成像仪：Protein Simple公司；电泳仪(042BR12088)：Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 分组 将30只大鼠随机分为空白组、模型组、黄蒲通窍胶囊组(1. 41 g/kg，按照体表面积折算法进行折算，相当于临床3倍等效量)，每组10只。

2.2 模型复制和药物干预 除空白组外，其余组别大鼠均腹腔注射100 mg/kg D-半乳糖，每日1次，共42 d。D-半乳糖腹腔注射21 d后，将大鼠固定在脑立体定位仪上，并使用微量注射泵将5 μL(10 μg)Aβ25-35缓慢注入双侧海马。以前囟为原点，向后4.4 mm、旁开2.2 mm为穿刺点，进针3.0 mm。空白组注射等量生理盐水。D-半乳糖处理14 d后，黄蒲通窍胶囊组大鼠根据体质量进行灌胃喂养。实验流程见图1。

图1 动物实验流程图

2.3 取材 大鼠麻醉后，腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，取血清，于-20 ℃冰箱保存，用于ELISA检测。每组取5只大鼠，处死后在冰面上取脑，仔细分离两侧海马组织，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱冻存，用于Western blot检测。剩余大鼠麻醉后，经心脏灌注4%多聚甲醛固定，取出固定的脑组织，用于苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色。

2.4 Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力 腹腔注射D-半乳糖37 d后进行实验，水温维持23～27 ℃，每日1次，共6 d。前4 d进行训练，将大鼠从四个象限之一放入水中，面向池壁，记录在90 s内找到平台所需的时间。如果大鼠在90 s内没有找到平台，则引导其到平台上并停留20 s帮助记忆。第5天从平台对侧象限将大鼠放入水中，将其找到平台所花费的时间记录为逃避潜伏期。在第6天移除平台并设置与导航实验相同的参数。记录老鼠在目标象限的路程及时间百分比。数据的采集和处理由Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成。

2.5 HE染色观察海马神经细胞损伤情况 每组取4只大鼠的脑组织固定后，通过常规脱水包埋、切片(厚度约为5 μm)制作脑组织切片后，通过HE染色法，光学显微镜下观察大鼠海马CA1区神经细胞损伤情况并拍照。

2.6 Western blot法检测海马组织中Wnt5、Frizzled和PLCβ蛋白表达水平 取剩下6只大鼠的新鲜海马组织进行总蛋白的提取，采用BCA法对海马总蛋白进行定量分析，10% SDS-PAGE电泳分离总蛋白，经转膜和封闭等流程后，再分别加入兔抗大鼠一抗Wnt5(1∶1 200)、Frizzled(1∶2 000)、PLCβ(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。加入山羊抗兔IgG，再加入ECL显影剂，最终通过FCM凝胶成像系统进行曝光拍照以及数据处理。以GAPDH为内参，计算目的蛋白与内参灰度值的相对比值。实验重复3次。

2.7 ELISA法检测血清三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)表达水平 采用ELISA法检测大鼠血清中IP3表达水平。具体操作参照试剂盒说明书。

3 结果

3.1 黄蒲通窍胶囊对AD大鼠学习记忆能力的影响 各组大鼠随时间的增加其逃避潜伏期曲线呈下降趋势，模型组逃避潜伏期曲线普遍高于其他两组，且从第4天开始趋于稳定。第5天水迷宫结果显示：与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；与模型组比较，黄蒲通窍胶囊组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。见表1。模型组大鼠找到第三象限平台的路线较其他两组明显延长。与空白组比较，模型组大鼠在目标象限的路程和时间百分比均显著下降(P<0.05)；与模型组比较，黄蒲通窍胶囊组大鼠在目标象限的路程和时间百分比均显著增加(P<0.05)。见图2。

表1 黄蒲通窍胶囊对大鼠第1-5天逃避潜伏期的影响

注：A.空白组；B.模型组；C.黄蒲通窍胶囊组；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 黄蒲通窍胶囊对AD大鼠海马CA1区形态学变化的影响 空白组大鼠海马神经细胞层数较多，排列紧密整齐，染色均匀，核仁深染，形态完整；模型组大鼠海马神经细胞形态明显改变，层数减少，排列松散不均匀，核仁固缩伴有明显破裂，死亡神经细胞多见；黄蒲通窍胶囊组大鼠海马神经细胞分布相对均匀，排列较为紧密。见图3。

图3 各组大鼠海马CA1区神经细胞形态学变化(HE染色，10×40倍)

3.3 黄蒲通窍胶囊对AD大鼠海马Wnt5、Frizzled和PLCβ蛋白表达水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠海马Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表达水平均明显增加(P<0.05)；与模型组比较，黄蒲通窍胶囊组大鼠海马Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。见图4。

图4 各组大鼠海马Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表达水平比较

3.4 黄蒲通窍胶囊对AD大鼠含药血清中IP3表达水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清中IP3表达水平明显增加(P<0.05)；与模型组比较，黄蒲通窍胶囊组大鼠血清中IP3的表达水平明显降低(P<0.05)。见图5。

注：A.空白组；B.模型组；C.黄蒲通窍胶囊组；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

Morris水迷宫实验通过迫使实验动物游泳，并学会寻找隐藏在水中的平台，被广泛用于评估动物的学习和记忆能力。通过各组大鼠的逃避潜伏期实验和第三象限路程及时间百分比实验结果可以看出：与空白组比较，模型组大鼠的学习和记忆能力显著下降；与模型组比较，黄蒲通窍胶囊组大鼠的学习和记忆能力显著改善。由HE染色实验结果可以看出：与空白组比较，模型组大鼠海马神经细胞萎缩破裂、层数减少、排列松散；与模型组比较，黄蒲通窍胶囊组大鼠海马神经细胞损伤减轻。Western blot法检测结果显示：与空白组比较，模型组大鼠Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表达水平均明显升高；与模型组比较，黄蒲通窍胶囊组大鼠Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表达水平均明显降低。ELISA法检测结果显示：与空白组比较，模型组大鼠IP3表达水平明显升高；与模型组比较，黄蒲通窍胶囊组IP3表达水平明显降低。

AD作为一种不可逆的神经退行性疾病，其特征是吞咽、行走能力和注意力、记忆力等认知功能的进行性丧失。随着国内和世界人口的持续老龄化，AD所带来的经济负担将逐年加重。尽管广大研究者为此已作出很多努力，但仍无法治愈AD[11]。

中医将AD归为“呆病”“善忘”范畴，其发病的主要病机为本虚标实，肾精亏虚是早期痴呆发生的基础，肾精亏虚，脑髓失充，元神失养，则头晕耳鸣，记忆力减退，思维迟钝[12]。AD的证型有肾虚髓亏、肝肾阴虚、痰蒙清窍、瘀阻清窍、心肝火旺、心脾两虚、气虚血瘀等[13]。黄蒲通窍胶囊中大黄消积化滞、逐瘀通经，石菖蒲开窍豁痰、醒神益智，人参大补元气、安神益智，益智仁暖肾温脾、益气健脑，川芎活血化瘀、行气止痛，制何首乌滋补肾阴、补益精血。诸药合用，益气补肾、豁痰化瘀，扶正与驱邪兼顾，符合中医治疗AD的基本原则。

Wnt蛋白是一类分泌型的糖蛋白。Wnt基因编码的分泌型糖脂蛋白包括Wnt1、Wnt3a、Wnt5a及Wnt11等[14]。Wnt蛋白通过与受体Frizzled结合诱导经典的Wnt/β-catenin通路和非经典的Wnt/Ca2+通路[15]。Wnt信号通路控制多种生物过程。研究[16]显示，Wnt/Ca2+与神经退行性疾病密切相关。在Wnt/Ca2+信号通路中，Wnt5可以与细胞表面的跨膜蛋白Frizzled结合刺激异源三聚体G蛋白，可进一步激活PLC，进一步增加IP3的水平[17-18]。IP3促进细胞内质网Ca2+释放，促使细胞膜上钙通道打开，Ca2+内流，导致细胞内Ca2+浓度增加，高水平的钙通过激活蛋白激酶C和磷酸酶钙调神经磷酸酶等钙依赖性蛋白，调节线粒体动力学，防止Aβ寡聚体诱导的线粒体断裂，调控抗凋亡线粒体蛋白Bcl-2的表达[17，19]。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，能够调控线粒体外膜通透性，抑制细胞凋亡的发生[20]。课题组前期研究[21]显示，黄蒲通窍胶囊能够增加AD大鼠模型海马Bcl-2的表达，抑制线粒体凋亡。另外课题组研究[8]显示，细胞内Ca2+浓度增加，导致CaM-CaMKⅣ信号通路激活，进一步导致Tau蛋白过度磷酸化。因此，笔者推测黄蒲通窍胶囊对AD模型大鼠的作用机制可能与抑制Wnt/Ca2+信通路，减少Ca2+超载，抑制CaM/CaMKⅣ信号通路，最终抑制Tau蛋白的过度磷酸化有关。