合生元制剂对阿尔兹海默病小鼠影响研究

张金鑫， 童亚楠， 郝珊瑚， 王治国， 张国旭

1.北部战区总医院 核医学科，辽宁 沈阳 110016；2.中国医科大学 北部战区总医院研究生培养基地，辽宁 沈阳 110016

阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease，AD)又名老年性痴呆，是一类起病较隐蔽、但呈慢性加重的神经系统退行性疾病，是痴呆症中最常见的一种类型。其病理特点主要是β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)异常堆积形成炎性斑块、Tau蛋白异常磷酸化形成纤维缠结，以及突触受损、神经元大量丧失等。目前，AD发病率呈上升趋势，但其发病机制尚不明确，且未发现具有显著治疗效果的药物和方法[1-3]。随着人口老龄化，AD将会带来严重的医疗、社会及经济问题[4]。因此，寻找能够高效防治AD的药物和方法已经成为研究热点。肠道菌群是影响人体健康的关键因素，肠道菌群失衡可能引起AD发生[5]。合生元制剂是益生元和益生菌的结合，在调节菌群平衡方面，服用合生元制剂比单独使用益生元或益生菌更有效[6-7]。本研究以APP/PS1痴呆小鼠为模型，观察服用合生元制剂对其行为学的影响，以及小鼠脑内海马和皮质区Aβ沉积情况，探讨合生元制剂治疗AD的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取24只APP/PS1痴呆小鼠，5月龄，雄性，体质量24～30 g；以及12只C57BL/6J野生小鼠，5月龄，雄性，体质量24～30 g。APP/PS1痴呆小鼠由雄性APP/PS1转基因小鼠和雌性野生型C57BL/6J小鼠交配所得。种鼠购于北京华富康生物科技股份有限公司，饲养于北部战区总医院药剂科动物房，所有小鼠自由进食水。本实验已获得北部战区总医院实验动物伦理委员会批准[Y(2021)024号]。

1.2 仪器与试剂 Morris水迷宫，切片机，摊烤片机，4%动物组织固定液，PV二抗试剂盒，DAB显色试剂盒，苏木素染色液，二甲苯，PBS磷酸盐酸缓冲液，无水乙醇，中性树胶，生物安全柜，重组Anti-beta Amyloid抗体(Abcam公司，稀释比例1∶100)，嗜酸乳杆菌(菌种编号LA-G80)，乳双歧杆菌(菌种编号BL-G101)，低聚木糖(上海润盈生物工程有限公司)。乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、低聚木糖制成冻干粉末，即合生元制剂。其中，含乳双歧杆菌2.5×109cfu/ml，嗜酸乳杆菌2.5×109cfu/ml，低聚木糖0.5 g。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及给药 采用随机分组的方式将APP/PS1痴呆小鼠分成两组，对照组和治疗组各12只；另将12只C57BL/6J小鼠作为空白组。所有动物适应性饲养1周后，治疗组和对照组小鼠分别灌胃合生元制剂和低聚木糖，每次给药剂量为0.5 ml/只，空白组小鼠灌胃等量的生理盐水，每天3次，持续灌胃3个月。

1.3.2 Morris水迷宫实验 给药结束后第2天，采用Morris水迷宫观察各组小鼠的记忆和空间学习能力。Morris水迷宫设备是由水下平台、圆形水池、标志物、视频采集系统及行为学分析系统组成。水池直径100 cm、高60 cm，其中，水深35 cm，留出25 cm的边缘放置提示方位用的标志物，分为4个象限(E、W、S、N)，平台放置于西北象限的中心、水面以下1～2 cm。水中滴加白色素，水温维持在20℃～22℃。按序将小鼠从4个象限放入水中，放置时小鼠面朝池壁，下水轻柔，每次游泳60 s，记下小鼠找到平台所用的时间(逃逸潜伏期)和游泳轨迹。若小鼠在规定时间找到平台则允许小鼠在平台停留15 s；若小鼠在规定时间未找到平台，引导小鼠找到平台，并让小鼠在平台停留15 s。每只小鼠每天游泳4次，连续5 d。第5天训练结束后，撤掉水下平台，将各组小鼠从平台所在象限的对侧放入水中，让其游泳60 s，记录每只小鼠在规定时间内穿越平台次数和目标象限停留时间。

1.3.3 脑组织取材及免疫组化检测 Morris水迷宫实验结束后，将所有小鼠脱颈处死，取出整个脑组织放入4%动物组织固定液中。将脑组织中的海马及皮层组织进行石蜡包埋，用于免疫组化检测，切片厚度为5 μm。检测步骤：(1)脱蜡、水化。切片用二甲苯浸泡3次，每次10 min；不同浓度乙醇分别浸泡5 min，蒸馏水冲洗3次，每次2 min。(2)3%甲醇过氧化氢孵育15 min，PBS缓冲液冲洗。(3)高压修复后将切片放入PBS缓冲液中。(4)切片上滴加一抗(重组Anti-beta Amyloid抗体)，4℃过夜，次日取出，PBS缓冲液冲洗3遍，每遍3 min。(5)切片上滴加二抗(生物素)，室温下孵育15 min，PBS缓冲液冲洗3遍，每遍3 min；DAB显色5～10 s，蒸馏水冲洗，终止显色。(6)苏木素复染，不同浓度乙醇脱水，二甲苯透明每10 min 2遍，随后封片。(7)电子显微镜观察，截取不同视野组织进行图像分析，存档。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行处理。Morris水迷宫数据采用GraphPad prism 8作图，统计分析采用重复测量数据方差分析，两两比较采用Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 合生元制剂对APP/PS1痴呆小鼠学习和记忆能力的影响 空白组、对照组、治疗组第5天Morris水迷宫实验各组小鼠游泳运动轨迹见图1。随着训练天数的增加，各组小鼠找到平台的时间逐渐缩短，但对照组小鼠进步不明显；与空白组比较，在实验的第3、4、5天时，对照组逃逸潜伏期显著延长，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，在实验的第4、5天时，治疗组逃逸潜伏期显著缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。与空白组比较，对照组穿越平台次数减少，目标象限停留时间缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，治疗组穿越平台次数增加，目标象限停留时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3～4。

图1 第5天Morris水迷宫实验各组小鼠游泳轨迹比较 图2 Morris水迷宫实验各组小鼠逃逸潜伏期比较

图3 各组小鼠穿越平台次数比较 图4 各组小鼠目标象限停留时间比较

2.2 合生元制剂对APP/PS1痴呆小鼠脑内海马及皮质区Aβ表达的影响 脑组织免疫组化检测结果显示，黄色斑块为阳性表达(黑色箭头示)。与空白组比较，对照组小鼠脑内海马及皮质区Aβ斑块表达增多；与对照组比较，治疗组小鼠脑内海马及皮质区Aβ斑块表达减少。见图5～6。与空白组比较，对照组脑内海马及皮质区平均光密度增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，治疗组脑内海马及皮质区平均光密度降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图7～8。

图5 各组小鼠脑内海马区Aβ表达情况(400倍，黑色箭头所指为Aβ斑块沉积)

图6 各组小鼠脑内皮质区Aβ表达情况(400倍，黑色箭头所指为Aβ斑块沉积)

图7 各组小鼠脑内海马区Aβ平均光密度比较 图8 各组小鼠脑内皮质区Aβ平均光密度比较

3 讨论

Morris水迷宫由英国心理学家莫里斯于1981年首次提出，主要用于评定啮齿类动物的记忆和空间学习能力[8]。Morris水迷宫利用啮齿类动物天生会水而又怕水的特点作为驱动力，强迫动物搜寻水下隐藏的平台，学会利用周围参照物与水下平台的关系，强化其空间探索和认知能力，是目前AD动物模型研究中使用最为频繁的行为学检测方法之一[9]。Morris水迷宫一般分为隐匿平台实验和空间探索实验两个部分。隐匿平台实验的目的是检测观察对象学习能力的大小，观测指标主要包括潜伏期、游泳轨迹、游泳速度、游泳距离及探索策略等；而空间探索实验的目的是检测观察对象空间记忆的维持能力，观测指标主要包括穿越平台次数、目标象限停留时间、游泳总距离等[10]。Morris水迷宫在大量啮齿类动物中的广泛应用证实了其有效性和可靠性[11-13]。

本研究主要以逃逸潜伏期评定各组小鼠的空间学习能力，以穿越平台次数和目标象限停留时间评定各组小鼠的空间记忆能力。Morris水迷宫实验结果显示：(1)与空白组比较，在实验的第3、4、5天时，对照组逃逸潜伏期显著延长，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，在实验的第4、5天时，治疗组逃逸潜伏期显著缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与空白组比较，对照组穿越平台次数减少，目标象限停留时间缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，治疗组穿越平台次数增加，目标象限停留时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果提示，APP/PS1痴呆小鼠存在明显的记忆和空间学习障碍，而合生元制剂可有效提高小鼠的记忆和空间学习能力，改善其认知功能损伤，延缓AD进程。免疫组化检测可分析合生元制剂干预后AD小鼠行为学改变的原因，结果显示：(1)与空白组比较，对照组小鼠脑内海马及皮质区Aβ斑块表达增多；与对照组比较，治疗组小鼠脑内海马及皮质区Aβ斑块表达减少。(2)与空白组比较，对照组脑内海马及皮质区平均光密度增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，治疗组脑内海马及皮质区平均光密度降低，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明，APP/PS1痴呆小鼠脑内海马及皮质区Aβ沉积多，符合AD小鼠的病理变化，且合生元制剂可降低APP/PS1痴呆小鼠脑内海马及皮质区的Aβ沉积。

综上所述，合生元制剂可有效降低APP/PS1痴呆小鼠脑内海马及皮质区Aβ沉积，显著增强小鼠的记忆和空间学习能力，改善认知功能损伤，从而延缓AD进程，为AD的防治提供了新的方向，但具体作用机理尚需进一步研究。