锁掷酵母预处理油脂原料膨化大豆

蒋云芝，徐萌萌，李由然，顾正华，石贵阳，丁重阳

（1.江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡214122）

随着社会发展和生活水平的提高，人们对健康问题日益关注，对食品的功能性也越来越重视。功能性油脂属于人类膳食油脂，是对人体健康有促进作用的一大类脂溶性物质。功能性油脂除了具有一般油脂所具有的功能外，还具有一些特殊生理功能，如可以减少心血管系统疾病的发生［1］，对高血压［2］、癌症［3］、糖尿病［4］和肥胖［5］等也有积极的防护作用。

目前，市面上的功能性油脂主要包括天然营养特性油脂、添加型功能油脂和结构脂质［6］。其中，添加型功能油脂是在油脂中添加一些功能性成分，主要有VE、VA、植物甾醇、谷维素和茶多酚等。但是功能性成分制备纯品复杂，价格昂贵，还需要后续添加调和，工艺步骤繁琐。因此，开发新型功能性油脂逐渐成为人们关注的热点和研究方向。

大豆中油脂含量18%～20%，是我国主要的食用植物油，2004年大豆油产量首次超过菜籽油，成为我国最大的食用植物油［7］。工业制取大豆油目前主要有压榨法和溶剂浸出法。膨化大豆由大豆挤压膨化所得，大豆在挤出模孔或突然喷出压力容器时，其因骤然降压而实现体积膨大［8］，形成松散结构，从而有效提高提油率［9］。经过膨化后的大豆不但能使饲料原料中的抗营养因子失活，而且有利于提高营养成分的消化利用率，同时还能改善其风味［10］。

类胡萝卜素与人体健康密切相关，具有抗氧化活性［11］、肝保护作用［12］、眼保健功效［13］、提供维生素A原［14］、抗肿瘤［15］、预防心血管疾病［16］等重要的生物学功能。因此利用红酵母进行固态发酵，可以改善发酵物营养价值，提高类胡萝卜素含量等［17－20］。

笔者所在实验室在前期研究中筛选得到产类胡萝卜素的3株红酵母，本研究对膨化大豆进行固态发酵预处理，期望得到富含类胡萝卜素的功能性油脂，并进一步通过适度优化提高油脂中功能性成分的含量，增加发酵豆粕的营养成分及功效，充分实现膨化大豆的高加值化应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）、黏红酵母（Rhodotorula glutinis）菌株皆保藏于由江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室。

1.1.2 主要试剂

酵母膏、蛋白胨，英国Oxoid公司；葡萄糖、石油醚、正己烷、二氯甲烷、丙酮等，国药集团上海化学试剂有限公司；十九烷酸甲酯、正己烷（色谱纯）、β－胡萝卜素标品，Sigma公司。

1.1.3 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）液体培养基（质量分数）：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%，pH自然。用于胶红酵母、锁掷酵母和黏红酵母的种子培养。

膨化大豆固体培养基（质量分数）：膨化大豆40%，水60%，pH自然。用于胶红酵母、锁掷酵母和黏红酵母的固态培养。

1.1.4 主要仪器

SZF－06C型脂肪提取仪，浙江托普云农科技股份有限公司；DRP－9082型电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；HC－2518型高速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；V－1200型可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；HYL－C型组合式摇床，太仓市实验设备厂。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

胶红酵母、锁掷酵母、黏红酵母种子培养：用接种环划取适量酵母菌体，接种于80 mL YEPD液体培养基中，30℃、200 r／min培养48 h。

胶红酵母、锁掷酵母、黏红酵母固态培养：向大豆培养基中加入质量分数40%的酵母种子培养基，30℃静置培养96 h。

1.2.2 生长曲线的绘制

将胶红酵母、锁掷酵母、黏红酵母菌株在YEPD斜面培养48 h后，用接种环划取适量酵母菌体，接种于80 mL YEPD液体培养基中，30℃、200 r／min培养100 h。以菌体生长时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制菌体生长曲线。

1.2.3 固态发酵膨化大豆后提取功能性油脂

将发酵后的样品取出，于55℃烘箱中烘干，烘干后的样品经粉碎机粉碎后，用脂肪提取仪提取粉碎后样品中的油脂。

1.2.4 固态发酵膨化大豆的发酵条件优化

1）培养时间的影响。固态发酵膨化大豆的培养时间分别为24、48、72和96 h，其余条件不变，每个3个平行，确定固态发酵膨化大豆最佳的培养时间。

2）培养基含水量的影响。培养基含水量分别为40%、50%、60%、70%（以干基计算），其余条件不变，每个3个平行，确定固态发酵膨化大豆最佳的培养基含水量。

3）接种量的影响。接种量分别为30%、40%、50%、60%（以干基计算），其余条件不变，每个3个平行，确定固态发酵膨化大豆最佳的接种量。

4）培养温度的影响。固态发酵膨化大豆的培养温度分别为26、28、30和32℃，其余条件不变，每个3个平行，确定固态发酵膨化大豆最佳的培养温度。

1.2.5 固态发酵膨化大豆含油率的计算

固态发酵膨化大豆含油率的计算见式（1）。

式中：m1为大豆油质量，g；m2为原料大豆的质量，g。

1.2.6 油脂中类胡萝卜素含量的测定

类胡萝卜素含量标准曲线的制定参照文献［21］：配制0.20 mg／mL的β－胡萝卜素标准溶液，分别吸取0、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20和6.40 mLβ－胡萝卜素标准溶液，用二氯甲烷定容至10 mL，在波长为450 nm处测其OD450，绘制标准品曲线。

样品溶液的制备：准确称量0.5 g油样于10 mL的棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容，摇匀，在波长为450 nm处测其OD450，代入标准曲线中计算类胡萝卜素含量。

1.2.7 豆粕中类胡萝卜素含量的测定

准确称取500 mg豆粕置于棕色瓶中，加入5 mL的丙酮［22］超声2 h，间隔20 min摇匀一次，超声后溶液于10 000 r／min离心10 min，取3 mL上清液，在可见分光光度计下测其OD487，参照Girard等［23］的方法计算类胡萝卜素产量。

式中：Amax为类胡萝卜素最大吸收波长下的吸光度；D为测定试样时的稀释倍数；V为提取所用溶剂量，mL；m为培养物质量，g。

1.2.8 油脂中脂肪酸含量的测定

油脂中脂肪酸含量的测定参照文献［24］：准确称取50 mg油脂，加入2 mL的0.5 mol／L的NaOHCH3OH溶液，65℃水浴皂化30 min。冷却至室温，加入2 mL的14%的BF3－CH3OH溶液，65℃水浴皂化30 min。冷却至室温，加入5 mL的正己烷振荡3～4 min提取脂肪酸甲酯，加入少许的无水Na2SO4进行脱水处理，10 000 r／min离心5 min，取上层有机相过0.22 μm的有机膜备用。

在甲酯化过膜后的溶液中以1∶1的体积比加入0.2 mg／mL的十九烷酸甲酯溶液（以正己烷作为溶剂）作为内标，对提取物中脂肪酸的含量进行气相色谱分析。

色谱条件：色谱柱为TR－FAME色谱柱（60 m×0.25 μm），检测器为氢火焰离子检测器（FID）。进样量1 μL，进样口温度225℃，检测器温度250℃，分流比为20∶1，线速为33 cm／s。

1.2.9 油脂指标的检测

气味和色泽参照文献［25］测定；酸值参照文献［26］测定；过氧化值参照文献［27］测定。

1.2.10 发酵豆粕指标的检测

蛋白含量参照文献［28］测定；水分含量参照文献［29］测定；灰分含量参照文献［30］测定；pH的测定：称取发酵后的新鲜豆粕5 g于100 mL锥形瓶中，加入50 mL去离子水，搅拌30 min后，用pH计测定溶液的pH。

2 结果与讨论

2.1 不同红酵母固态发酵膨化大豆产富含类胡萝卜素功能性油脂的结果

2.1.1 红酵母固态发酵生长曲线

图1为红酵母生长曲线。由图1可知：胶红酵母、锁掷酵母和黏红酵母的生长趋势一致，在0～13 h细胞生长处于迟滞期，在13～70 h细胞生长处于对数生长期，70 h之后细胞生长趋于稳定，处于稳定期。因此，接下来的实验选择发酵48 h的酵母种子液进行接种。

图1 红酵母生长曲线Fig.1 Growth curve of yeast

2.1.2 红酵母发酵大豆后的油脂提取结果

将胶红酵母、锁掷酵母和黏红酵母种子液分别接种至膨化大豆培养基中，在30℃培养箱中静置培养96 h。其中，胶红酵母发酵的样品培养基颜色最浅，为淡橘色；黏红酵母发酵的样品培养基颜色最深，为深橘色；锁掷酵母发酵的样品培养基颜色介于两者之间。采用索氏抽提法对样品进行油脂的提取，结果如图2所示。

图2 不同酵母发酵大豆后提取的油脂Fig.2 Oil extracted from soybeans fermented by different yeasts

从图2可以看出：原始大豆提取的油脂为淡黄色，胶红酵母提取的油脂为淡橘黄色，锁掷酵母提取的油脂为深橘黄色，黏红酵母提取的油脂为玫红色。测定4个样品的含油率，结果如表1所示。由表1可知：发酵后样品的含油率略低于未发酵样品的含油率，这可能是由于发酵过程中酵母生长代谢所致。

表1 样品含油率Table 1 Oil extraction rate

2.1.3 油脂中脂肪酸分析结果

对油脂进行脂肪酸定性和定量分析，结果如表2所示。由表2可知：4种油脂中脂肪酸的主要组成成分相同，均含有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，且这5种脂肪酸含量占总脂肪酸含量的98.7%以上。此外，还含有少量的豆蔻酸、棕榈油酸、花生酸、花生烯酸和山嵛酸。4种油脂都以不饱和脂肪酸——油酸、亚油酸和亚麻酸为主，其中，油酸、亚油酸和亚麻酸含量最多的均为锁掷酵母固态发酵膨化大豆所提取的油脂。综上，胶红酵母、锁掷酵母和黏红酵母对发酵膨化大豆提取油脂极具有开发价值。

不饱和脂肪酸包括单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，它们是功能性脂肪酸研究和开发的主体和核心。由表2还可知，4种油脂中多不饱和脂肪酸的含量明显多于单不饱和脂肪酸的含量，含有丰富的多不饱和脂肪酸，且经过发酵后没有改变脂肪酸的组成，但脂肪酸的含量有所增加，符合人们对健康的需求，可以作为功能性油脂加以研究和开发利用。

表2 酵母发酵大豆油脂中脂肪酸含量Table 2 The content of fatty acid in soybean oil fermented by 3 yeasts mg／g

2.1.4 油脂和豆粕中类胡萝卜素含量分析结果

对油脂和豆粕中的功能性成分类胡萝卜素进行含量测定，结果如图3所示。由图3可知：未发酵样品的油脂中类胡萝卜素的含量为2.300 μg／g，胶红酵母、锁掷酵母和黏红酵母发酵样品的油脂中类胡萝卜素含量分别为6.724、15.010和9.032 μg／g，相比于未发酵样品所提取的油脂中类胡萝卜素含量皆有显著性提高（P＜0.05）。其中，锁掷酵母发酵样品所提取的油脂中类胡萝卜素含量最高，比未发酵样品提高了5.526倍，其次为黏红酵母和胶红酵母发酵样品，分别比未发酵样品提高了2.927倍和1.923倍。

图3 酵母发酵大豆油脂及豆粕中类胡萝卜素含量Fig.3 The content of carotenoids in oil and soybean meal

而在豆粕中，未发酵样品中类胡萝卜素的含量为1.035 μg／g，胶红酵母、锁掷酵母和黏红酵母发酵样品中类胡萝卜素含量分别为8.062、6.422和7.627 μg／g，相比于未发酵样品类胡萝卜素含量皆有显著性提高（P＜0.05）。其中，胶红酵母发酵样品的类胡萝卜素含量增加最多，比未发酵样品提高了6.789倍；其次为黏红酵母和锁掷酵母发酵样品，分别较未发酵样品提高了6.369倍和5.205倍。由此可见，经过红酵母发酵预处理，油脂和豆粕中的类胡萝卜素的含量均有显著提高，表明其营养价值提高。

根据油脂中脂肪酸以及类胡萝卜素的定量分析结果，选择锁掷酵母固态发酵膨化大豆以获得富含类胡萝卜素的功能性油脂。

2.2 锁掷酵母固态发酵膨化大豆的条件优化结果

为了进一步提高类胡萝卜素含量，获得高品质、高活性的功能性油脂，对锁掷酵母固态发酵膨化大豆进行工艺优化，其中优化条件包括培养时间、培养基含水量、接种量和温度。

2.2.1 培养时间的优化结果

为了提高油脂中类胡萝卜素的含量，对锁掷酵母固态发酵膨化大豆的培养时间进行优化，培养时间分别为24、48、72和96 h。

对油脂及豆粕的类胡萝卜素进行分析，结果见图4。由图4可知：随着培养时间的延长，油脂和豆粕中类胡萝卜素的含量均先增加后降低，其中，在培养时间为72 h时，类胡萝卜素的含量皆达到最大值，分别为15.157、9.128 μg／g。由此可见，发酵时间对类胡萝卜素的积累影响较大。因此，根据油脂中类胡萝卜素含量的变化，初步选取最佳培养时间为72 h。

图4 不同培养时间对油脂和豆粕中类胡萝卜素含量的影响Fig.4 Effects of fermentation time on carotenoids content in oil and soybean meal

2.2.2 培养基含水量的优化结果

水分是固态发酵培养基的极其重要的组成成分，水可以将营养物质溶解，便于微生物利用。为了寻找最佳的培养基含水量，在上述优化条件下，继续对培养基含水量进行优化，在培养基含水量为40%、50%、60%和70%（以干基计算）的条件下对锁掷酵母固态发酵膨化大豆产类胡萝卜素进行分析。由于培养基含水量的改变会影响酵母的生长情况，因此，在最佳培养时间的基础上，提前和延迟一定的培养时间。

测定油脂及豆粕中的类胡萝卜素含量，结果如图5所示。由图5可知：随着培养时间的增加，不同培养基含水量梯度下，油脂中类胡萝卜素的含量先增加后降低，且在培养时间为72 h时油脂中类胡萝卜素的含量皆达到最大值。其中，培养基含水量为50%的油脂中类胡萝卜素的含量最高，为15.515 μg／g。

图5 不同培养基含水量对油脂和豆粕中类胡萝卜素含量的影响Fig.5 Effects of water content on carotenoids content in oil and soybean meal

豆粕中类胡萝卜素的含量也是随着培养时间的增加呈现先增加后降低的趋势，且在培养时间为72 h时含量皆达到最大值。其中，培养时间为72 h时，培养基含水量为40%的豆粕中类胡萝卜素的含量达到最大值，为13.700 μg／g；培养基含水量为50%的豆粕中类胡萝卜素的含量为8.152 μg／g。

根据油脂中类胡萝卜素含量的变化，确定类胡萝卜素含量最高的培养基含水量为最佳条件。虽然含水量为50%的豆粕中类胡萝卜素的含量比含水量为40%的豆粕中类胡萝卜素的含量有所降低，但是，本研究主要目的是为了获得具有功能性成分的油脂。因此，选择最佳培养基含水量为50%。

2.2.3 接种量的优化结果

接种量会对菌体生长延滞期产生一定的影响。在上述优化条件下，继续对接种量进行优化，在接种量梯度为30%、40%、50%和60%对锁掷酵母固态发酵膨化大豆产类胡萝卜素进行分析，结果见图6。

由图6可知：随着培养时间的延长，油脂和豆粕中类胡萝卜素的含量均先增加后降低，且在培养时间为72 h时类胡萝卜素的含量皆达到最大值。其中，培养时间为72 h时，接种量为50%的油脂中类胡萝卜素的含量最高（15.997 μg／g），豆粕中类胡萝卜素的含量也达到最大值（8.625 μg／g）。

图6 不同接种量对油脂和豆粕中类胡萝卜素含量的影响Fig.6 Effects of inoculation amount on carotenoids content in oil and soybean meal

接种量过小，造成局部菌种生长缓慢，影响类胡萝卜素积累；接种量过大，菌体初期生长迅速，培养液黏度增加，导致溶氧不足，过早达到发酵终点，不利于类胡萝卜素形成和积累［31］。因此，选取50%接种量为最佳接种量。

2.2.4 培养温度的优化结果

温度对类胡萝卜素的影响较大，在上述优化条件下，继续对培养温度进行优化，在26、28、30和32℃条件下对锁掷酵母固态发酵膨化大豆产类胡萝卜素进行分析，结果如图7所示。

图7 不同培养温度对油脂和豆粕中类胡萝卜素含量的影响Fig.7 Effects of culture temperature on carotenoids content in oil and soybean meal

由图7可知：随着培养时间的延长，油脂和豆粕中类胡萝卜素的含量均先增加后降低，且在培养时间为72 h时类胡萝卜素的含量皆达到最大值。其中，培养温度为30℃的油脂中类胡萝卜素的含量最高（16.200 μg／g），培养温度为30℃的豆粕中类胡萝卜素的含量也达到最大值（8.630 μg／g）。

培养温度过高或者过低都会影响类胡萝卜素的积累，发酵温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，类胡萝卜素的生产期提前；温度过高，酶易因过热而失去活性，菌体容易衰老，发酵周期缩短，影响类胡萝卜素的最终产量。研究发现红酵母固态发酵产类胡萝卜素的适宜温度在25～35℃，与文献［32］结果相似。因此，选取30℃为最佳培养温度。

综上，合适的培养条件有助于类胡萝卜素的积累，提高发酵效率。经过对锁掷酵母固态发酵工艺的优化，确定最佳的培养条件：培养基含水量50%、接种量50%、培养温度30℃、发酵时间72 h。优化后油脂中类胡萝卜素含量为16.200 μg／g，较优化前提高了7.928%；豆粕中类胡萝卜素的含量为8.630 μg／g，较优化前提高了34.382%。

2.3 理化指标分析结果

2.3.1 油脂理化指标

对锁掷酵母固态发酵膨化大豆前后提取的油脂的色泽、气味、酸值和过氧化值进行测定，结果如表3所示。由表3可知：发酵前后的油脂都具有大豆原油固有的气味，无异味，色泽、酸值及过氧化值都均符合大豆原油的国家标准［25］。

表3 油脂理化指标Table 3 Physical and chemical parameters of oil

经过锁掷酵母发酵膨化大豆提取的油脂的酸值和过氧化值均高于未发酵样品，这可能是因为在酵母的生长过程中分泌较多的脂肪酶，加速了大豆脂肪的水解，从而使得发酵后样品的酸值增高。同时，在酵母生长过程中，会增加脂肪酸与氧气接触的机会，致使过氧化值有所增高。

2.3.2 豆粕理化指标

对锁掷酵母发酵前后的豆粕的蛋白含量、灰分、水分和pH按国家标准［33］进行测定，结果如表4所示。由表4可知：发酵后豆粕的蛋白含量增加约5.260%，水分提高23.245%，灰分降低9.208%；豆粕pH变化更为显著，由原始中性6.791降低至酸性4.557，可以减少饲料中酸化剂的使用，降低成本。由此可见，经过锁掷酵母发酵膨化大豆所得豆粕，其营养价值有所提高，有助于其在饲料领域的高值化应用。

表4 豆粕理化指标Table 4 Physical and chemical parameters of soybean meal

3 结论

本研究应用锁掷酵母对膨化大豆进行发酵预处理和培养条件初步优化，得到富含类胡萝卜素的功能性油脂以及营养豆粕，且油脂中脂肪酸组成没有发生变化。发酵样品油脂中类胡萝卜素含量较未发酵样品提高了5.526倍，经过进一步发酵工艺的优化后，油脂中类胡萝卜素含量为16.200 μg／g，较优化前提高了7.928%；豆粕中类胡萝卜素的含量为8.630 μg／g，较优化前提高了34.382%。本研究为新型功能性油脂的开发研究提供了新的思路和方法，可以依据不同的微生物所具有的生物活性物质的特异性，开发针对不同人群的、具有不同功能性成分的油脂产品。

锁掷酵母固态发酵膨化大豆所提取的油脂含有丰富的类胡萝卜素，为开发富含微生物来源的生物活性物质、营养价值提升的功能油脂产品奠定了研究基础，提供了新的思路。根据不同的微生物产生物活性物质的含量与种类，可以开发出针对不同人群的功能性油脂产品。同时，锁掷酵母预处理膨化大豆提取油脂后所得豆粕的营养价值也有所提高，即通过一步发酵预处理实现了膨化大豆的综合高价值开发利用。