甜玉米籽粒总 RNA 提取方法的比较

于惠琳，吴玉群，王延波，张洋

（辽宁省农业科学院玉米研究所，辽宁沈阳 110161）

甜玉米是因一个或几个突变基因存在，使得籽粒淀粉的合成途径受阻，从而使果糖、蔗糖和还原糖等可溶性糖类在玉米籽粒中大量积累的一类特用玉米[1]。甜玉米因籽粒含糖量高、营养丰富，在市场中占有重要地位。甜玉米籽粒糖积累的主要形式是蔗糖、果糖和葡萄糖，三者构成了可溶性糖的 90%以上，其中以蔗糖含量为最高[2]。

随着现代分子生物手段的发展，高通量测序已被应用到挖掘甜玉米籽粒糖积累的相关基因和分子调控机理研究中。而该项技术能够顺利开展的前提是能够提取到高纯度、高质量的总 RNA。目前，玉米不同部位总 RNA 的提取方法有SDS 法[3-4]、CTAB 法[5]、Trizol 法[4]、异 硫氰酸胍法等，而不同提取方法对同一组织材料提取差异也很大。因为甜玉米籽粒富含糖，而糖类的很多理化性质与 RNA很相似，这种含有多糖的 RNA 沉淀难溶于水，去除多糖的同时，RNA 也容易被带走，造成 RNA 得率很低，因此从甜玉米籽粒提取高质量、完整的 RNA 难度很大。该研究用RNAiso 法得到了甜玉米籽粒高纯度、高质量的总 RNA。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以超甜玉米系 SY01 为试验材料，2020 年春季在辽宁省农业科学院试验地种植（沈阳）。取授粉后 20d甜玉米籽粒，液氮速冻带回实验室，-80℃保存备用。

1.2 试验试剂

乙醇、异丙醇、氯仿、醋酸钠 、RNase-free ddH2O、RNAiso Plus 试剂（大连宝生物 TaKaRa）、Trizol、DNA 消化酶、RDD buffer、Tris、Na2EDTA、琼脂糖、液氮。

1.3 试验方法

1.3.1总 RNA 提取（RNAiso 法）。取 100 mg 甜玉米籽粒，加入1mL RNAiso-mate 充分混匀；4℃10 000 r/ min 离心5 min，小心取上清液加入等体积的 RNAiso Plus，振荡使溶液乳化，静置5min；加入上清 1/5 体积量的氯仿，振荡15 s，静置5min；10 000 r/min 4℃下离心 15 min，将上清液转移到新的管中；再加入等量的异丙醇，混匀后室温下放置 10 min；10 000 r/min 4℃下离心 10 min，试管底部会有沉淀出现，弃上清液，加入1mL 75%的乙醇，以洗去沉淀中所含的盐分，重复1次；4℃ 10 000 r/min 瞬时离心后弃去乙醇，加入适量 RNase-free ddH2O，用移液枪吸打沉淀直至沉淀溶解。

1.3.2Trizol 法。取 100 mg 甜玉米籽粒，加入1mL Trizol提取液，震荡混匀放置5min，离心 15 min，取上清液加入200 uL 氯仿，混匀，冰上放置 10 min，离心 15 min，取上清液加入 2/3 体积异丙醇，冰上放置 10 min；离心 20 min，弃上清液；加入 75%的乙醇 1mL，洗涤沉淀；离心5min，弃上清液，用 DEPC 水溶解沉淀 RNA。

1.3.3CTAB 法。取 100 mg 甜玉米籽粒，加入 65℃预热的CTAB提取液（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA pH 8.0，1.4 mol/L NaCl，2.5% CTAB，2%巯基乙醇，2% PVP），65℃水浴 10 min；离心后取上清液，加入等体积的水饱和酚：氯仿（25∶24），再加入 800 μL NaCl（5 mol/L），混匀，室温放置 3min，离心后取上清液，加入等体积的异丙醇和2 倍体积的 NaCl（5 mol/L），混匀，放 -80℃过夜沉淀，沉淀用75%乙醇洗2次，室温下晾干，加适量 DEPC 水溶解。

1.3.4DNA 酶消化。取 30 μg总RNA 放入离心管，加入2.5 μL DNAⅠ，10 μL RDD buffer，RNase-free ddH2O 补至100 μL，混匀后 25℃金属浴 14 min；加入 50 μL Trizol，50 μL RNase-free ddH2O，40 μL氯仿，混匀静置3min，12 000×g 4℃离心 15 min，尽量取多的上清液到新离心管，加入1/10体积3mol/L 醋酸钠，再加入等体积异丙醇，混匀，-20℃放 1～2 h，4℃ 13 600×g 离心 15 min；弃上清液，加入1mL 75%的乙醇，以洗涤管壁，用 RNase-free ddH2O 溶解。

1.4 RNA 纯度、完整性和浓度检测

用 1%的琼脂糖凝胶电泳初步分析 RNA 提取物的清晰度和完整性；用 Nanodrop 2000 测定 RNA 浓度 （单位ng/μL）和 OD260/280，OD260/280的值在 1.8～2.2 之间，说明 RNA的纯度较好；用 Agilent 2100 Bioanalyzer 检验 RNA 的质量。

2 结果与分析

2.1 甜玉米籽粒总 RNA 完整性检测

用 RNAiso-mate 结合 RNAiso Plus 提取了甜玉米籽粒的总RNA。能看到RNA含有 28S 、18S rRNA条带（图 1A），且条带边缘较清晰，无拖尾和弥散现象。28S 核糖体 RNA 的量约为 18S 核糖体 RNA的1.5～2.0 倍，表明提取的 RNA 较完整，没有降解，没有多糖、蛋白等污染。表明该方法适用于甜玉米籽粒总 RNA 的提取。图 1B 为Trizol 法提取的 RNA 电泳，28S 部分降解，18S 条带亮度明显高于 28S 条带，且有拖尾现象。CTAB 法提取的 RNA 有少量 DNA、多糖污染（图 1C），有拖尾现象。因此，Trizol 法和 CTAB 法不适合提取高质量的甜玉米籽粒的总 RNA。

图1 甜玉米籽粒总 RNA 的凝胶电泳

将 RNAiso 法提取的总 RNA用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析仪进行质量检测，样品 28S 峰和 18S 峰清晰可见，无杂峰，该结果与琼脂糖电泳结果一致（图 2）。

图2 甜玉米籽粒总 RNA 的毛细管电泳

2.2 甜玉米籽粒总 RNA 纯度、浓度分析

用 Nanodrop 2000 对总 RNA 进行纯度、浓度检测（表 1），OD260/280值应在 1.8～2.2 之间，OD260/280值低于 1.8 说明有蛋白、糖类、酚类污染，OD260/280值高于 2.2 说明 RNA 降解或有高盐污染；且 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测的 RIN≥7，以保证下游高质量 small RNA-seq 文库的构建。Trizol 法提取的 RNA 样品，OD260/280值为 2.28，说明 RNA 样品有部分降解 ，浓度明显低于RNAiso法提取的 RNA样品，且RIN＜7，无法进行后续测序。CTAB 法提取的 RNA 样品，OD260/280值为 1.75，说明有少量 DNA、多糖污染，总 RNA 浓度明显低于 RNAiso法提取的 RNA样品，且 RIN＜7。RNAiso 法提 取的 RNA 样品，OD260/280值为 2.09，浓度为1 250 ng/μL，总量为 18.75 μg，RIN 值为 8.6，无 RNA 降解，无 DNA 污染，该方法提取到高质量甜玉米籽粒总 RNA。

表13种方法提取甜玉米籽粒总 RNA 的浓度、纯度

3 结论与讨论

提取高纯度、高质量的 RNA 是分子生物学试验的一个关键环节。甜玉米籽粒富含糖，而糖类的很多理化性质与RNA 很相似，这种含有多糖的 RNA 沉淀难溶于水，去除多糖的同时，RNA 也容易被带走，造成 RNA 得率很低。该研究比较了 RNAiso 法、Trizol 法、CTAB 法对甜玉米籽粒总 RNA的提取效果。Trizol 法提取的总 RNA 有降解，CTAB 法提取的总 RNA 有少量 DNA、多糖污染，试验周期较长，这2种方法得到的 RNA 浓度明显低于 RNAiso 方法。采用 RNAiso 方法，增加了 RNAiso-mate 试剂，有效地裂解多糖多酚材料的细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚并释放出来。加入氯仿使有机相和水相分层，用异丙醇使 RNA 快速沉淀，用 75%乙醇洗涤来溶解一些沉淀中可能的有机质，同时可去除痕量的异丙醇和氯仿等有机溶剂。RNAiso 方法既有效除去了多糖和蛋白质，又保证了 RNA 样品的纯度和完整性，因此该方法适合玉米籽粒总 RNA 的大量提取。