真姬菇在藜麦固体培养基上发酵条件的探讨

李奕葶，安 琪，刘禹良，孙 宁，黄 亮，班立桐

（天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384）

真姬菇（Hypsizigus marmoreus）又称斑玉蕈，属于大型木质腐生菌。由于近些年对食用菌营养成分研究的深入，真姬菇的很多生理活性被揭示出来。郑守晶等[1]从真姬菇子实 体中 提取的可溶 性膳食 纤维，具 有降低糖尿 病小鼠血糖值的效果。刘继攀等[2]证实真姬菇水溶性多酚具有较好的清除 DPPH、ABTS·+2种自由基的能力。日本学者大槻誠[3]证实真姬菇子实体具有降低大鼠的血清总胆固醇、磷脂、三酰甘油酯的功效。

藜麦是一种起源于南美洲的谷物，营养价值极高，具有“全面型谷物”的美称，可以作为微生物的固体培养基质。藜麦富含酚类物质且含量明显高于小麦、小米等其他谷物 。多 酚可以抗炎和抗 癌，还可以预 防糖尿病、心血管疾病[4]。藜麦中富含黄酮，黄酮具有多种药理作用，例如降三高、抗癌、防癌等[5]。皂苷，也称为角苷，主要由糖基和皂苷元 组成[6]，是藜麦种 子的 主要活性抗氧 化剂 成分。研究发现皂苷具抑 菌、降 脂等生 理功效，藜麦麸中的皂苷 可占其质量的 20%～30%[7]。

固体发酵是一种传统的发酵的方式，可以维持微生物原有的生长状 态，有利于发酵代谢产物积累[8]，并可以提高培养基质生理活性物质的含量。研究表明，用香菇菌丝体发酵藜麦后，其多糖含量增加了 31 倍[9]。豆粕经北冬虫夏草菌 丝体 发酵后，其多糖含量均有 所提 高，并 具有较显著的生理活性[10]。云芝、裂褶菌和香菇固体发酵苦荞基质后总黄酮含量分别为 3.03%、2.87%和 3.11%，明显高于未发酵苦荞（2.43%）[11]。

基于 此，该次研 究利用真姬菇菌丝 体发 酵藜麦，以多糖为指标，通过固体发 酵方 法，不 同发 酵条件对发酵产物多 糖产量的影响 ，并在最适发酵条件下测定多糖 、多酚、黄酮、蛋白质以及皂 苷的含量，综合评价发酵 产物 作为新型食品原料的可行性。

1 材料与方法

1.1 材 料

真姬 菇菌 种，保 存于天津农学院食 用菌 研究中心；藜麦，市购。

1.2 试 剂

芸 香叶苷，上海麦克林生化 科技有限公司；香草醛，天津天远化工有限公司；福林酚，上海麦克林生化科技有限公司；考马斯亮蓝 G-250，Beyotime 生物技术有限公司。

1.3 仪器与设备

LDZX-30FBS 立式 压力 蒸汽灭菌锅，上海申安医 疗器械厂；离心机，上 海安亭科学仪器厂 ；酶标 仪，珀金埃 尔默企业管理（上 海）有 限公司；T6NewGentury 分光光度计，北京普析通用仪器公司；JY88-Ⅱ超声细胞粉碎机，宁波新芝生物技术公司。

1.4 方 法

1.4.1藜麦前处理。选用饱满无杂质的藜麦，并用粉碎机粉碎成粉末，60℃烘干，注意防潮保存。

1.4.2菌种活化、转接、培养。PDA 试管斜面培养基：取马铃薯切块，加入1L 水煮沸，过滤，加 20g葡萄糖、20g琼脂、pH 自然。灭菌后，将真姬菇菌种转接到 PDA 培养基中。25℃恒温培养，将试管放入其内，培养 10 d，使菌种活化。

种子液培养：配置 PDA 液体培养基，装液量为 100 mL/250 mL，每瓶接入6块约 0.5 cm2大小的真姬菇菌丝块，25℃下恒温摇床 150 rpm/ min 培养6d。

1.4.3真姬菇固体发酵藜麦的单因素试验。

（1）碳源筛选。探讨葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、糊精5 种碳源对多糖产量的影响。25g藜麦培养基中加入 0.5%（w/w）蛋白胨作为氮源，每种碳源添加量为 1%（w/w），含水量 60%（干重），接种量为 10%（v/w），25℃ 静置培养 10 d。发酵后取出固体发酵产物于 60℃烘干、磨粉、过筛，并测定发酵产物中多糖含量，根据多糖含量确定最适碳源。

（2）氮源筛选试验。探讨蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硝酸铵、硫酸铵5种氮源对多糖产量的影响。藜麦培养基中加入 1%（w/w）最适碳源，0.5%（w/w）筛选氮源，试验条件与上述单因素试验相同，测定发酵产物中多糖含量，根据多糖含量确定最适氮源。

（3）碳源、氮源添加量筛选试验。探讨碳源、氮源添加量分别为 1/15、1/10、1/5、1/1、5/1、10/1、15/1、20/1 时对多糖产量的影响。藜麦培养基中加入 0.5%（w/w）最适氮源，按不同的碳源、氮源添加量比值加入最适碳源，其他试验条件与上述单因素试验相同，测定发酵产物中多糖含量，根据多糖含量确定最适碳源、氮源添加量。

（4）含水量筛选。探讨含水量（干重）分 别为 40%、50%、60%、70%、80%时对多糖产量的影响。培养基中加入上述取最佳条件碳氮源，其他试验条件与上述单因素试验相同，测定发酵产物中多糖含量，根据多糖含量确定最适含水量。

（5）发酵时间筛选。探讨时间分别为 10、15、20、25、30 d时对多糖产量的影响。藜麦培养基中，加入上述最佳条件的碳、氮源，调整培养基至最适含水量，其他试验条件与上述单因素试验相同，分别培养 10、15、20、25、30 d。测定发酵产物中多糖含量，根据多糖含量确定最适发酵时间。

1.4.4生理活性物质测定。

（1）总糖含量测定。总糖含量测定依照苯酚-浓硫酸法[12]并利用超声辅助提取（150 W、30 min）。称量藜麦干粉、发酵干粉，按 1：20 料液比加入蒸馏水并煮沸2h，离心后加入4倍体积乙醇，并放 4℃冰箱过夜，离心收集沉淀，待酒精挥发后，将沉淀再次溶于蒸馏水。取1mL 样品，依次加入 0.5 mL 5%苯酚，2.5 mL 浓硫酸，热水浴 20 min。冷却后于 490 nm 处测定吸光值。

（2）黄酮含量测定。各称取藜麦干粉、发酵干粉，按1∶20 料液比加入 70%乙醇，60℃水浴2h，离心取上清。0.4 mL 上清液中加入 0.4 mL 5% NaNO2，反应6min，加0.4 mL 10% AlNO3摇匀，反应6min，再 加入4mL 4%NaOH，反应 15 min[13]，于 510 nm 测定吸光值。

（3）多酚含量测定。利用福林酚试剂测定未发酵与发酵藜麦中多酚的含量。称取藜麦干粉、发酵干粉，按 1∶20料液比加入 70%乙醇，60℃水浴2h，离心取上清。250 μL上清液中加入 250 μL 10% 福林酚试剂，再加入 250 μL 20% NaCO3，最后加入 1.75 mL 水，放置黑暗 90 min，于360 nm 测吸光值。

（4）可溶性蛋白质含量测定。称取1g 藜麦干粉、发酵干粉，加入2mL 蒸馏水研磨，转移至离心管中，用水冲洗3 次，每次2mL，收集提取液并离心，取上清液定容至 10 mL。取 0.1 mL 样品提取液，添加 0.9 mL 蒸馏水，5 mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，反应2min，于 595 nm 测定吸光值。

（5）皂苷含量测定。称取藜麦干粉、发酵干粉，按 1∶20料液比加入 90%乙醇，200W超声处理 30 min，离心后收集上清液。取 0.2 mL 70℃干燥水浴，加入 0.2 mL 5% 香兰素-冰醋酸，0.8 mL HClO4，60℃水浴 15 min，冷却后加入5 mL 冰乙酸暗反应 15 min[14]，于 550 nm 测定吸光度值。

2 结果与分析

2.1 真姬菇固体发酵藜麦的单因素试验

2.1.1碳源筛选结果。碳源作为主要能源参与并构成菌株及其代谢产物[15]。由图1可知，真姬菇对糊精与乳糖的利用率较 好，最 适碳源为糊精。糊精为 添加 碳源时，发酵产物多糖含量为（130.22±2.95） mg/g。吴秀珍等[16]研究结果揭示，可溶性淀粉为真姬菇菌丝体的最佳碳源。糊精是淀粉经过 酶降解之后的产物 ，是一种小 分子物质，因此更容易被真姬菇菌丝体利用。

图1 不同碳源对多糖产量的影响

2.1.2氮 源筛选结果 。氮源主 要用于 构建菌类的细胞物质[15]。真姬菇可以利用氨基酸，无机氮源和复合氮源。根据文献 可知，复合氮源更利 于真姬菇菌丝体多糖产 物的积累，原因是复 合氮源中有很多利 于菌 丝体生长代谢的小分子物质。由图2可知，真姬菇对复合氮源酵母粉的利用效果最佳，多糖产量为（148.51 ±2.37） mg/g。真姬菇对蛋白胨的利用效果 仅次于酵母 粉，对牛肉膏 的利用较差，因此选择酵母粉作为最佳氮源。

图2 不同氮源对多糖产量的影响

2.1.3碳源、氮源添加量筛选结果。从图3可以得知，当碳源添加量不足时，多糖产量较低，随着碳源添加量逐渐增大，多糖产量趋于平缓，当碳源添加量到一定值时，多糖产量下降。当碳氮源添加量比值为 5∶1 时多糖产量最高，为（186.34±0.87）mg/g，因此最适碳氮源添加量比值为 5∶1，与林有照的试验结论相吻合[17]。

图3 不同碳氮源添加量对发酵产物中多糖产量

2.1.4含水量筛选结果。王光耀[18]指出，高含水量的固体培养基易染杂菌，低含水量的固体培养基菌丝生长不旺盛。由图4可知，当含水量为 40%～70%之间时，真姬菇多糖产量无明显变化，含水量为 80%时，多糖含量上升，因此，最适含水量为 80%，多糖产量为（194.77±1.16） mg/g。固体培养基的孔隙率对菌丝生长至关重要[19]。由于藜麦中含有粘性物质，藜麦干粉溶于水后具有一定的粘性，含水量低于 80%时，培养基孔隙率较低不利于真姬菇菌丝体生长。含水量充足时，真姬菇菌丝体可以利用培养基中层甚至底层的物质，因此多糖产量较高。

图4 不同含水量对发酵产物中多糖产量的影响

2.1.5发酵时间筛选结果。如图5所示，随着发酵天数的增加，菌丝体逐渐增长，多糖产量也随之增加。当发酵天数为20d时 ，多糖 产量达 到最大值 ，此时多糖产量为（204.71±3.60） mg/g 。发酵 20d以上，多糖产量降低，考虑原因是由于菌丝体老化，多糖的分解量大于合成量，故最适发酵时间为 20 d。

图5 不同发酵时间对发酵产物中多糖产量的影响

2.2 最适发酵条件下生理活性物质的含量

2.2.1多糖含量。如表1所示，发酵前藜麦中多糖含量为（5.24±0.11） mg/g，当 发酵条件为2.5%（w/w干重）糊 精、0.5%（w/w 干重）酵母粉、80%（w/w 干重）含水量、10%（v/w）接种量、25℃ 、发酵20d时 ，多糖含量为（204.71 ±3.60）mg/g，比发酵前提高了 39 倍。

表1 最适发酵条件下各生理活性物质的含量 mg/g

2.2.2多酚含量。如表1发酵前藜麦多酚含量为（2.45±0.23）mg/g，发酵后多酚含量为（20.44±1.41）mg/g，发酵后多酚含量提高了8倍。金针菇发酵藜麦后的多酚含量，为未发酵藜麦的2倍左右[20]。使用开菲尔乳杆菌发酵藜麦后，多酚含量增长8倍[21]。发酵后多酚含量的增加可能是由于发酵产生的代谢产物转化为酚类化合物[16]。

2.2.3黄酮含量。邓杰等[22]测得藜麦中黄酮含量为 0.14 mg/g，由表1可知本试验中藜麦干粉中黄酮含量为 （0.12 ±0.04）mg/g，与文献测定值相近；发酵产物中黄酮含量为（1.37±0.12）mg/g，发酵后黄酮含量提高了 11.4 倍。陈树俊[21]研究显示，使用开菲乳杆菌发酵藜麦后，黄酮含量增加了3.5 倍，发酵后黄酮含量的增加的机制可能与多酚相同，与发酵次生代谢产物的转化有关。

2.2.4皂苷含量。如表1可知，藜麦发酵前皂苷含量为（2.03±1.20）mg/g，发酵后皂苷含量为（5.78±2.41） mg/g。发酵后比发酵前皂苷含量提高3倍。而游新勇等[23]研究结果指出，藜麦皂苷的最高含量为 1.66 mg/g，皂苷含量差异可能与藜麦产地以及播种期有关[24]。

2.2.5可溶性蛋白含量。如表1所示，蛋白质发酵前后分别为（159.52 ±5.01） mg/g，（97.42 ±6.50） mg/g，发酵后 蛋白质含量下降，可能与蛋白质被微生物产生的蛋白酶降解为氨基酸有关。延莎等[25]利用酵母、植物乳杆菌以及混合菌发酵藜麦，研究结果表明，发酵后的藜麦游离氨基酸含量明显增加，必需氨基酸均增加 10 倍左右，非必 需氨基酸可增加 3～7 倍，总游离氨基酸可增加 5～9 倍。

3 结论

（1）最适发酵条件为：在藜麦固体培养基上添加 2.5%（w/w干重）糊精、0.5%（w/w干重）酵母粉、80%（w/w干重）含水量、25℃发酵 20 d。

（2）最适发酵条件下，发酵产物中多糖含量为（204.71±3.60） mg/g，比发酵前提高了 39倍；多酚含量为（20.44±1.41） mg/g，比发酵前提升了8倍；黄酮含量为 （1.37±0.12） mg/g，比发酵前提高了 11.4倍；皂 苷含量 比发酵前提高了3倍，为（5.78±2.41） mg/g；蛋白质含 量在发 酵后有所下降，含量为（97.42±6.50）mg/g。