酶解辅助超声法提取花生红衣原花青素的工艺研究

胡江波，王海凤，许梦婷，唐赛赛

山东中医药高等专科学校 (烟台 264199)

花生是我国主要油料作物之一，年产量居世界第一。花生红衣是花生加工的副产物，是传统的中药成分，具有止血散瘀、消肿之功效，且兼有补肾养胃、润肺止咳、补中益气、清肠排毒的疗效[1-3]。花生红衣中含有多种活性物质，如黄酮、白藜芦醇、原花青素等。其中原花青素是自然界广泛存在的一类多酚类化合物，由不同数量的儿茶素和表儿茶素缩合而成，具有良好的抗氧化性和清除自由基能力[4-5]。目前原花青素作为营养强化剂、天然抗氧化剂、天然防腐剂等，被广泛应用于食品、药品、化妆品等领域[6]。在花生加工业中，花生红衣一直没有得到充分的综合利用，因此更加合理有效地利用花生红衣资源，提取其中的天然活性成分，具有重要的社会与经济效益。

目前，国内外提取原花青素的主要方法为溶剂提取法，但为了缩短提取时间、提升提取的效率，更好的应用于生产，多种辅助提取的方法逐渐应用其中，例如可产生机械效应与热效应的微波及超声波辅助提取法、可产生空化效应的超临界流体提取法和打破植物细胞壁而促进提取物加快溶出的酶解法等[7]。纤维素酶是一种较为理想的植物细胞壁溶解酶，能够有效破坏植物细胞壁，加速活性物质的释出，从而提高原花青素得率[8]。本试验以花生红衣为原料，利用纤维素酶辅助超声波法提取原花青素，并对原花青素的抗氧化性进行分析，为花生红衣的深加工和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生红衣、原花青素标准品(纯度≥98%)，上海伊卡生物技术有限公司；纤维素酶(酶活性15 000 U/g)，青岛蔚蓝生物股份有限公司；DPPH，上海北诺生物科技有限公司；香草醛、浓盐酸、乙醇等，均为分析纯。

UV-2450分光光度计，日本岛津公司；AL204电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；小型中药粉碎机，永康市云达机械设备厂；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1原花青素标准曲线绘制

取标品10.0 mg，用少量乙醇溶解，用蒸馏水定容至10 mL容量瓶中，混匀，配置0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL标液。分别吸取标液0.5 mL放入25 mL试管，以蒸馏水做空白对照，加入3 mL 4%香草醛-甲醇液和1.5 mL浓盐酸，立即混匀，室温避光显色15 min，在500 nm下测吸光值。以标品的质量浓度为横坐标，以样品的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2原花青素得率的测定

将花生红衣在 60 ℃条件下烘干至质量恒定，粉碎，过40目筛，得到花生红衣粉。称取20 g花生红衣粉，加入一定量纤维素酶和50%乙醇水溶液，放入超声仪中进行酶解、超声提取，将提取液离心，上清液按一定比例稀释，以蒸馏水为空白，分别加入 1.5 mL 的浓盐酸溶液和3.0 mL香草醛溶液，混匀后室温避光反应15 min，测定吸光值。吸光值带入回归方程可得到样品的质量浓度，乘以稀释倍数即可得出提取液中样品的质量浓度，根据以下公示可计算得出原花青素的得率。

原花青素得率=C×n×V/m×100%

式中：C为提取液中原花青素质量浓度，mg/mL；n为提取液的稀释倍数；V为提取液体积，mL；m为花生红衣质量，mg。

1.2.3单因素试验

准确称取5份干燥粉碎后的花生红衣样品20 g， 加入一定量50%乙醇水溶液，分别以料液比(m/v)、纤维素酶添加量、提取温度及超声提取时间四因素中的三个因素为固定因素，余下一个因素水平为变量进行单因素试验，之后逐一更换变量因素，直至每个因素都轮换到。每个因素作为固定因素时确定条件分别为料液比(m/v)1∶16、纤维素酶添加量0.2%、提取温度50 ℃、超声提取时间40 min。提取液经离心、过滤后定容，测其吸光度A500并计算原花青素的得率，根据单因素试验确定料液比、纤维素酶添加量、提取温度、提取时间这4个因素对原花青素得率的影响，并确定较优的提取条件。

1.2.4正交试验

在单因素试验的基础上，对4个因素分别取3个水平，以得率作为考察指标，按照 L9(34)正交表进行优化组合试验。正交试验因素与水平设计见表 1。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5花生红衣原花青素抗氧化性的分析

取 2 mL 浓度为 0.004% 的 DPPH-甲醇溶液，分别加入0.1 mL不同浓度的原花青素样品液，振荡混合均匀后，室温避光静置反应 30 min，以甲醇为空白，测定 525 nm波长下的吸光值。以抗坏血酸作为阳性对照，进行3组平行试验，计算花生红衣原花青素和抗坏血酸对 DPPH 自由基的清除率。

清除率=1-[(A-B)/A0]×100%

式中：A0为加甲醇的DPPH溶液的吸光值；A为样品与DPPH反应后的吸光值；B为样品空白(0.1 mL样品+2 mL甲醇)。

2 结果与讨论

2.1 原花青素标准曲线

原花青素标准曲线如图1所示，标准曲线回归方程为Y=1.028 6X+0.048 1，R2=0.999。

图1 原花青素标准曲线

2.2 原花青素提取工艺的单因素试验结果

2.2.1提取温度对得率的影响

在料液比(m/v)1∶16，纤维素酶添加量0.2%，超声提取时间40 min的条件下，调整提取温度分别为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，提取花生红衣原花青素，计算原花青素的得率，实验结果见图 2。如图所示，提取温度在40 ℃～55 ℃之间时，原花青素的得率随温度的升高而提高。原因可能是纤维素酶的活力随着温度升高而增大，，加强了对花生红衣纤维的酶解，使得相应提高。当温度超过55 ℃时得率降低，这可能是由于温度超过了纤维素酶的最适温度，降低了酶活力，削弱了酶解能力，导致得率降低。因此选择提取温度为 55 ℃最为合适。

图2 提取温度对原花青素得率的影响

2.2.2提取时间对得率的影响

在料液比(m/v)1∶16，纤维素酶添加量0.2%，提取温度50 ℃的条件下，提取时间依次调整为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，提取花生红衣原花青素并计算得率，实验结果见图3。由图可知，提取时间在20～40 min之间，原花青素的得率随时间延长而提高，40 min以后得率基本维持不变。原因可能是反应初期底物浓度较高，纤维素酶与底物接触的更完全，随着反应时间延长，原花青素得率逐渐升高。40 min以后，底物消耗殆尽，酶解作用结束，得率基本稳定。

图3 提取时间对原花青素得率的影响

2.2.3纤维素酶添加量对得率的影响

在料液比(m/v)1∶16，提取温度50 ℃，超声提取时间40 min的条件下，纤维素酶添加量依次调整为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，提取花生红衣原花青素并计算得率，实验结果见图4。纤维素是细胞壁的主要组成成分，纤维素酶能水解花生红衣细胞壁中的纤维素，破坏细胞壁的致密结构，加速原花青素的溶出[9-10]。 由图4可知，随着纤维素酶添加量增大花生红衣原花青素得率逐渐升高，当添加量超过0.3%时，得率基本不变。从成本考虑，选择纤维素酶添加量为0.3%。

图4 纤维素酶添加量对原花青素得率的影响

2.2.4料液比对得率的影响

在纤维素酶添加量0.2%，提取温度50 ℃，超声提取时间40 min的条件下，料液比(m/v)依次调整为1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20，提取花生红衣原花青素并计算得率，实验结果见图5。由图5可知，原花青素的得率随料液比的增加而增大，在 1∶18时达到最大值。选择料液比1∶18较为合适。

图5 料液比对原花青素得率的影响

2.3 正交试验结果与分析

正交试验结果见表2。由表2可知，4个因素对花生红衣原花青素得率的影响主次顺序为B>A>C>D，即提取时间影响最大，其次是提取温度和纤维素酶添加量，料液比影响最小。从K值来看，最佳工艺条件为A3B2C2D1，即提取温度55 ℃，提取时间40 min，纤维素酶添加量0.3%，料液比(m/v)1∶20。

按照正交试验确定的最佳提取工艺进行验证试验，花生红衣原花青素的得率为10.97%。在提取温度55 ℃，超声提取时间40 min及料液比(m/v)1∶20的条件下，不添加纤维素酶，花生红衣原花青素的得率仅为9.32%。因此正交试验确定的最佳提取工艺优于所有试验中的得率。

表2 正交试验结果表

2.4 原花青素的抗氧化能力

花生红衣原花青素对 DPPH 自由基的清除能力见图6。由图可知，花生红衣原花青素提取液具有抗氧化活性，随着原花青素浓度的增加，DPPH自由基清除率相应增加，当原花青素浓度达到0.28 mg/mL以上时，清除率不再明显升高，可能是由于DPPH减少到一定程度后，与原花青素芳香环上的羟基可结合的概率降低，导致原花青素芳香环上的羟基直接与PheO结合，在自由基的清除能力上表现为趋于平衡[11]。同时从图上可以看出，与相同浓度的抗坏血酸相比，花生红衣原花青素提取物对DPPH自由基的清除能力略低。

3 结论

采用纤维素酶辅助超声提取法对花生红衣原花青素提取工艺进行研究，在单因素试验的基础上，通过4因素3水平正交试验得出最佳提取工艺参数为提取温度55 ℃、提取时间40 min、纤维素酶添加量0.3%、料液比(m/v)1∶20，此条件下测得原花青素的得率为10.97%，而相同实验参数下不添加纤维素酶测得原花青素得率为9.32%。通过对花生红衣原花青素提取物进行体外抗氧化性分析，得出花生红衣原花青素对DPPH具有较强的清除能力，但与抗坏血酸相比，其对自由基的清除率略低。本研究具有得率高、提取时间短、提取物抗氧化能力强等优点，为花生红衣的深加工和综合利用提供了理论依据。

图6 花生红衣原花青素对 DPPH 自由基的清除能力