影响右旋糖酐比旋度因素的研究

慕 娟，问清江，郑巧霞，孙晓宇，丁 浩

( 陕西省微生物研究所， 陕西 西安 710043)

右旋糖酐(Dextran)是主要由葡萄糖α-1,6糖苷键连接而成的葡聚糖[1]，具有增加血容量、改善微循环、防止弥散性血管内凝血的作用，主要用于治疗失血性休克，是目前公认的优良血浆代用品之一。临床上应用的常有3种规格产品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。右旋糖酐的生产原理：蔗糖经肠膜状明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)产生的右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase；E.C.2.4.1.5)合成右旋糖酐(粗酐)，粗酐进一步水解、分离纯化为药品右旋糖酐[2～3]。一切糖类都有不对称碳原子，所以都具有旋光性，旋光性是鉴定糖的一个重要指标[4]。偏振光透过长1 dm且1 mL中含有旋光物质1 g的溶液，在一定波长与温度下测得的旋光度。测定的比旋度可以区别和检查物质的纯杂度程度，亦可以用以测定含量[5]。比旋度可以衡量右旋糖酐的纯度，是产品质量标准中的一个重要指标。右旋糖酐的生产过程中所涉及到的糖主要有右旋糖酐、蔗糖、果糖和葡萄糖，它们都有各自的比旋度(表1)。我国右旋糖酐产品的比旋度和日本、欧美等国家存在差异(表2)，这不仅仅是数据的差异，实质是产品纯度的差别，单从比旋度这一指标来看，我国右旋糖酐产品纯度低于其他国家。在右旋糖酐生产过程中，蔗糖是发酵的主要原料，果糖是产量大于右旋糖酐的主要发酵产物，葡萄糖主要产生于右旋糖酐的水解，这三者是右旋糖酐生产过程中需要去除的主要糖类杂质，它们的残存影响右旋糖酐的质量，通过比旋度可以表现出来。因此右旋糖酐的比旋度不仅是产品的质量指标，而且要作为工艺过程中的考察指标，将其影响因素作为研究对象，既可以改进生产工艺，又可提高产品质量。以右旋糖酐40作为对象，分别以粗酐、发酵液和膜处理发酵液为原料，采取盐酸水解和右旋糖酐酶酶解制备右旋糖酐40，采用乙醇分离纯化和膜分离纯化两种不同方法从水解液中分离右旋糖酐40，对工艺过程和产品的比旋度进行检测分析，从而探究对右旋糖酐40比旋度的影响因素。

表1 右旋糖酐生产过程中所涉及糖在20℃(钠光)时的比旋度[4]

表2 不同国家右旋糖酐40比旋度[5～7]

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 葡萄糖(D-(+)-Glucose), 果糖(D-(-)-Fructoes),Sigma 公司产品；蔗糖(AR)；其他试剂为市售分析纯。

1.1.2 粗酐 陕西省微生物研究所自制。

1.1.3 仪器 WZZ-2S自动旋光仪(上海光学仪器五厂有限公司)；85-2数显恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)； 2010A-HT高效液相色谱仪(苏州贝锐仪器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 粗酐水解制备右旋糖酐40 粗酐浓度6%，盐酸0.1%，温度95℃，水解时间2.5 h，水解结束按照1%加入粉末活性炭，95℃搅拌保温40min，过滤收集滤液，乙醇分级纯化分离右旋糖酐40。

1.2.2 发酵液水解制备右旋糖酐40 按照盐酸0.16%，温度95℃，水解时间3.5 h水解右旋糖酐发酵液，水解结束按照1%加入粉末活性炭，95℃搅拌保温40min，过滤收集滤液，乙醇分级纯化分离右旋糖酐40。

1.2.3 膜处理发酵液水解制备右旋糖酐40 发酵液经板框过滤，陶瓷膜微滤，滤过液经5 000膜超滤分理去除果糖等小分子，超滤截留液为发酵液处理液；在盐酸浓度0.08%，水解时间3.0h，温度95℃条件下水解；水解结束按照1%加入粉末活性炭，95℃搅拌保温40 min，过滤收集滤液；滤液经过5 000，10 000，20 000，50 000和100 000超滤膜多种组合分离右旋糖酐40。

1.2.4 比旋度测定[5]精密称取样品，加水溶解并定量稀释成每1 mL中约含10 mg的溶液，在25℃时，依法测定比旋度(通则0621)。

1.2.5 分子量与分子量分布[5]取样品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜作为供试品溶液。另取4～5个已知分子量的右旋糖酐对照品，依法检查(通则0514)。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对右旋糖酐比旋度的影响

粗酐经过盐酸水解，活性炭吸附除杂，过滤收集滤液按照43.5%加入乙醇，搅拌均匀，40℃保温20 h，倾出上清液，弃去沉淀。上清液分别以52%，53%，54%，55%，56%不同浓度继续加入乙醇，室温放置24 h，倾出上清液，收集沉淀，干燥取样检测比旋度(表3)。

表3 乙醇浓度对右旋糖酐比旋度的影响(1)

粗酐经过右旋糖酐酶酶解，活性炭吸附除杂，过滤收集滤液，分别54%，55%，56%不同浓度加入乙醇，室温放置24 h，倾出上清液，收集沉淀，干燥取样检测比旋度(表4)。乙醇分离纯化采用了两种方法，两次分化和一次分化，从表3～表4可以看出，待分溶液相同的条件下，随着乙醇浓度的增加，比旋度下降，也就是分离得到的右旋糖酐的杂质增多。原因在于，右旋糖酐分子量越大，沉淀需要的乙醇浓度越低，乙醇浓度增加，可以沉淀更多的小分子糖类及其他杂质。

表4 乙醇浓度对右旋糖酐比旋度的影响(2)

2.2 多级分离纯化对右旋糖酐比旋度的影响

不同浓度的乙醇可以沉淀出不同分子量的右旋糖酐，分子量越大，沉淀时需要的乙醇浓度越低，相反分子量越小，沉淀时需要的乙醇浓度越高，右旋糖酐的分离纯化就是依据这一特征进行的。一般情况下，对于高分子右旋糖酐水解液采用乙醇多级分离纯化，可以得到不同分子量的右旋糖酐产品。表5是采用四级乙醇分离纯化时测定的比旋度，从中可以看出，三级纯化的比旋度均低于同一水解液出发的四级纯化比旋度。这一结果与2.1结果不同，原因在于三级分化的乙醇浓度为54%，收集沉淀后的上清液继续加入乙醇至60%，溶液体积增大，溶液中的杂质浓度变小，四级沉淀时，裹夹在沉淀产品中的杂质相应降低，四级产品比旋度高于三级，四级分离纯化产品的纯度高于三级。

表5 多级分离纯化对右旋糖酐比旋度的影响

2.3 不同水解原料和方法对右旋糖酐比旋度的影响

2.3.1 粗酐水解对右旋糖酐比旋度的影响 粗酐分别进行了盐酸水解和右旋糖酐酶解制备右旋糖酐40，乙醇分离沉淀右旋糖酐40采取了不同的方法，分级分离和一次性沉淀(表6～表8)，结果表明，分级沉淀优于一次性沉淀；分级沉淀分离中分别进行直接取出沉淀和75%乙醇洗涤沉淀，后者优于前者，尤其是粗酐盐酸水解，75%乙醇洗涤沉淀后比旋度从+176.1提高到+192.4，提高9.25%；右旋糖酐酶酶解粗酐的产品品质优于盐酸水解产品，直接取出沉淀产品的比旋度分别为+192.7和+176.1，75%乙醇洗涤沉淀产品分别为+196.6和+192.4，酶解直接取出沉淀产品与盐酸水解75%乙醇洗涤沉淀产品在同一水平，比旋度达到中国药典产品标准，酶解75%乙醇洗涤沉淀产品比旋度达到日美欧产品标准，位于国际最高水平。右旋糖酐酶酶解粗酐制备右旋糖酐40产品的比旋度高于盐酸水解制备产品的原因在于，盐酸水解存在残留蔗糖、小分子右旋糖酐与大分子右旋糖酐的竞争水解，且前者竞争性大于后者，结果导致蔗糖优先降解为果糖和葡萄糖，小分子右旋糖酐进一步降解为更小的杂糖分子，水解液分子量分布不均，小分子类杂质过多；右旋糖酐酶具有专一性，且右旋糖酐分子量越大与右旋糖酐酶的亲和力越强，阻止了残留蔗糖的水解，改善了酶解液分子量的分布，克服了盐酸水解小分子杂质过多的缺点[8～9]。

表6 粗酐盐酸水解乙醇分级分离纯化右旋糖酐的比旋度

表7 粗酐右旋糖酐酶酶解乙醇分级分离纯化右旋糖酐的比旋度

表8 粗酐右旋糖酐酶酶解90%乙醇一次沉淀分离右旋糖酐的比旋度

2.3.2 发酵液水解对右旋糖酐比旋度的影响 右旋糖酐发酵液直接水解制备右旋糖酐40，优点在于可以简化工艺，降低耗材，提高产率。肠膜状明串珠菌Lm-1226以蔗糖为主要原料，在其产生的右旋糖酐蔗糖酶的作用下将蔗糖转化为右旋糖酐和果糖，发酵液中果糖的量稍大于右旋糖酐，另外还有蔗糖残留；发酵液水解后还有葡萄糖等。因此分离纯化的负荷增加，需要在产品品质和产率之间寻找平衡点。右旋糖酐发酵液盐酸水解乙醇分级沉淀结果见表9，直接取出沉淀产品的比旋度+170.3，75%乙醇洗涤沉淀产品的比旋为+178.0，产品比旋度提高4.5%，但是没有达到产品标准。将右旋糖酐发酵液盐酸水解制备的右旋糖酐产品采用乙醇再沉淀方法进一步分离纯化(表10)，经过乙醇在沉淀，产品的比旋度均达到国家标准，但是分子量分布却发生了变化。No1所用的原料是53%乙醇分离纯化的产品，No2和No3所用的原料是54%乙醇分离纯化的产品，再沉淀试验中分别选取了原来沉淀的乙醇浓度和另外一个乙醇浓度，分子量分布均发生了变化，原沉淀乙醇浓度变化最大，重均分子量平均提高8.77%，随着乙醇浓度的进一步提高，对分子量的分布降低，60%、65%和70%乙醇浓度再沉淀后重均分子量的提高分别为4.79%、3.26%和3.31%。分离纯化的右旋糖酐产品不是单一分子量的的物质，而是具有重均分子量和一定分子量分布的物质，其中既有一定要求的大分子和小分子，溶解后再次沉淀，部分小分子不会沉淀，乙醇的再沉淀会改变重均份力量和分子量分布，提高乙醇浓度会降低这种变化。因此在采用乙醇再沉淀要考虑到这一点，根据分子量分布，选择适合的乙醇浓度。

表9 右旋糖酐发酵液盐酸水解乙醇分级分离纯化右旋糖酐的比旋度

表10 乙醇再沉淀分离纯化右旋糖酐

表11 右旋糖酐发酵液酶解乙醇分级分离纯化右旋糖酐的比旋度

右旋糖酐酶降解右旋糖酐发酵液,乙醇分级分离纯化的结果见表11，直接取出沉淀的比旋度为+171.7，75%乙醇洗涤沉淀1次的比旋度增加至+182.2，比旋度提高10.6；75%乙醇洗涤沉淀2次的比旋度增加至+187.1，比旋度提高15.4； 75%乙醇洗涤沉淀5次的比旋度增加至+190.6，比旋度提高18.9，达到国家标准。

2.3.3 膜处理发酵液水解对右旋糖酐比旋度的影响 右旋糖酐发酵液经过板框过滤、陶瓷膜微滤和超滤膜超滤之后盐酸水解，分离纯化选择两种不同途径，乙醇分级分离纯化结果见表12，产品比旋度达到国家标准；超滤膜分离和60%乙醇一次性沉淀组合结果见表13，产品比旋度有所提高，平均达+194.7，其中还有达到国际最高标准+195.0。发酵液膜处理分离出的右旋糖酐可以达到传统工艺中乙醇沉淀的粗酐水平，前者可以替代后者，可以得到发酵液中的主要副产物果糖，大大减少乙醇用量，省去粗酐溶解工艺过程。膜处理发酵液水解，水解液利用超滤膜和乙醇沉淀组合提高产品品质，有望达到国际先进水平。

表12 膜处理发酵液盐酸水解乙醇分级分离纯化右旋糖酐的比旋度

表13 膜处理发酵液盐酸水解膜分离+ 60%乙醇一次性沉淀右旋糖酐的比旋度

3 结论

右旋糖酐的比旋度是衡量产品的一个重要指标，右旋糖酐生产过程中的蔗糖、果糖、葡萄糖等主要小分子糖类物质是影响其的一个主要方面。从发酵液开始的不同分离纯化，不同水解方法等工艺过程来探究影响右旋糖酐产品比旋度的各种影响因素。同一右旋糖酐水解溶液应用乙醇沉淀法分离纯化时，随着乙醇浓度的增加，比旋度下降，也就是分离得到的右旋糖酐的杂质增多，产品品质降低。多级乙醇沉淀分离纯化右旋糖酐时，在一定范围内，后面(乙醇浓度高)分离得到的右旋糖酐比旋度大于前面(乙醇浓度低)的右旋糖酐，也就是高浓度乙醇沉淀产品品质优于底浓度乙醇沉淀产品。以粗酐、右旋糖酐发酵液、膜处理右旋糖酐发酵液分别作为原料盐酸水解制备右旋糖酐40，粗酐和膜处理右旋糖酐发酵液获得产品品质优于发酵液获得的产品，粗酐水解液乙醇分级沉淀分离纯化产品比旋度+192.4，达到国家标准；膜处理右旋糖酐发酵液水解液，乙醇分级沉淀分离纯化产品比旋度+191.9，达到国家标准，膜分离和乙醇一次性沉淀组合分离纯化产品平均比旋度+194.7，有望达到国际最高标准(+195.0)；发酵液水解液乙醇分级纯化产品比旋度+178.0，进一步采用乙醇再次沉淀分离纯化产品比旋度达到国家标准+190以上。右旋糖酐的水解采用右旋糖酐酶的酶解和盐酸水解两种方法，酶解产品品质优于盐酸水解产品品质，粗酐盐酸水解产品达到国家标准，而粗酐酶解产品比旋度+196.6，达到国际最高标准；右旋糖酐发酵液盐酸水解采用了乙醇分级沉淀和乙醇再沉淀组合分离纯化产品比旋度达到国家标准，右旋糖酐发酵液酶解只用了乙醇分级沉淀分离纯化产品比旋度就达到国家标准。用75%的乙醇洗涤沉淀除杂是一个重要的工艺环节，无论应用那种原料水解或那种水解方法，在目标沉淀得到后，经过洗涤后可以提高产品比旋度，多次洗涤效果更好。