pH 响应性吡唑醚菌酯/沸石咪唑酯骨架材料纳米颗粒的制备及抑菌活性

程敬丽, 肖豆鑫, 梁文龙, 方 逊, 张家栋, 赵金浩

(浙江大学 农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室，浙江省作物病虫生物学重点实验室，杭州 310058)

目前已有多种以环境响应性纳米材料为载体递送农药的报道[7]。金属有机骨架(metal organic frameworks，MOFs)作为一种具有规则孔隙率和稳定结构的高表面微型结晶多孔材料，通常由无机金属 (Ag、Zn、Cu、Fe、Cr、Zr、Ti 等) 和有机配体通过分子自组装形成[8]。由于其机械稳定性强，且具有超高的孔隙率和比表面积[8]，已被广泛探索用于气体存储、分离、催化、农药吸附和药物输送[9-13]。MOFs 作为基于纳米粒子的高效传递平台，在生物医学应用方面表现出巨大的潜力[14]，而其作为载体在农药控缓释方面的研究却鲜有报道。由2-甲基咪唑(2-mim)和锌离子(Zn2+)组成的沸石咪唑酯骨架材料ZIF-8 是一类极具应用前景的农药递送载体材料，具有较高的比表面积和相对较低的细胞毒性[15]，是MOFs 的一个子类[16]。与含有重金属(Cu、Zr 和Cr)的MOFs 相比，Zn2+对环境比较安全。据报道，ZIF-8 可用作提高作物产量和品质的肥料[17]。此外，由于ZIF-8 具有酸敏感性，在酸性条件下骨架结构容易坍塌[18-21]，因此适用于构建pH 响应性输送系统，应用于不同病虫害暴发场景，例如：某些真菌在生长和侵染作物过程中会分泌有机酸，为其繁殖提供有利条件[22]；某些病害容易在酸性土壤中暴发[23-24]；或者根据植物不同部位pH 的不同[25]、昆虫中肠肠液与高等动物消化系统pH 的不同，选择性释放农药，从而达到提高农药利用率的目的。

油菜Brassica napusL. 是全球第二重要的油料作物，通常用作食用油、生物柴油和优质动物饲料的基础原料[26-27]，但其在整个生长季均易被油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum侵染，而这种病菌侵染油菜时会分泌草酸，导致侵染部位的微环境呈酸性，从而可增强病菌释放细胞壁降解酶的活性[28-29]，提高病菌对作物的浸染能力，这可能导致10%～20% 的油菜产量损失，严重时可达80%[30-31]，可见酸性微环境是导致油菜菌核病致病的重要因素之一。吡唑醚菌酯 (pyraclostrobin，以下简称Pyr) 对油菜菌核病菌具有良好的抑制活性，但其对光不稳定，且为非内吸性农药，显著影响了其药效的发挥[32]。鉴于此，本文拟以ZIF-8 为载体，使其负载Pyr，并以油菜菌核病菌侵染油菜时的产酸微环境作为载体瓦解释药的响应开关，制备pH 响应性吡唑醚菌酯缓控释制剂 (简称Pyr@ZIF-8) ，并进一步评估其释放性能、抗光降解性能及抑菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

98%吡唑醚菌酯 (pyraclostrobin，Pyr) 原药(上海阿拉丁试剂有限公司) ；30%吡唑醚菌酯乳油 (东莞市瑞德丰生物科技有限公司，以下简称Pyr EC) ；吐温-80 (分析纯，北京索莱宝科技有限公司) ；甲醇 (色谱纯，美国Fisher 公司) ；无水乙醇 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司) ；2-甲基咪唑 (纯度98%) 和六水合硝酸锌 (纯度99%)(上海麦克林公司) 。

油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum，由浙江大学生物技术所提供。

BS210S 万分之一电子天平 (德国赛多利斯公司) ；Zetasizer Nano ZS-90 马尔文激光粒度仪（英国马尔文公司）；G300 扫描电子显微镜 (德国卡尔蔡司股份公司) ；D8 Focus X 射线粉末衍射仪(德国布鲁克公司) ；Nicolet Ava-tar370 傅里叶变换红外光谱仪 (FTIR，美国赛默飞世尔科技公司) ；LC-20A 高效液相色谱仪 (日本岛津株式会社) ；THZ-103B 恒温培养摇床 (上海一恒科学仪器有限公司) ；TG-16 高速离心机 (四川蜀科仪器有限公司) ；LGJ-10 真空冷冻干燥机 (北京松源华兴科技有限公司) ；RXZ-310C 恒温光照培养箱 (宁波江南仪器厂) 。

1.2 ZIF-8 及吡唑醚菌酯载药颗粒的制备

1.2.1 ZIF-8 的制备 按照文献报道方法[33]稍加改进：将六水合硝酸锌0.372 g (1.25 mmol)溶于5 mL去离子水中，配制成质量浓度为74.4 mg/mL 的溶液。称取6.15 g (7.5 mmol) 2-甲基咪唑溶于45 mL去离子水中，然后慢慢滴加5 mL 上述配好的六水合硝酸锌水溶液，室温下磁力搅拌15 min，搅拌转速为600 r/min。反应结束后在10 000 r/min 下离心15 min，沉淀用无水乙醇清洗(10 mL × 3 次)，30 ℃真空干燥得到ZIF-8 样品，用作后续试验的载体对照。

1.1 资料来源 采用多阶段PPS抽样和随机等距抽样相结合的方法进行样本抽选。如在抽中的样本县内，对所有乡(镇)按照人均纯收入排队，采用入样概率与上年该乡(镇)活产数成比例的PPS抽样方法，抽取5个样本乡(镇)。按同样方法每个乡(镇)抽取3～5个样本村。在抽中的样本村内，对该村所有6～24个月的婴幼儿按照出生日期进行排序(年龄由小到大)，采用随机等距抽样方法抽取12～20个婴幼儿样本。共抽取7个贫困县(区)2 100名6～24个月婴幼儿。

1.2.2 吡唑醚菌酯载药颗粒 (简称Pyr@ZIF-8) 的制备 将10 mg Pyr 原药溶于10 mL 无水乙醇中，配制成 10 000 μg/mL 的Pyr 乙醇溶液；称取6.15 g (7.5 mmol) 2-甲基咪唑，用45 mL 去离子水溶解后，先滴加5 mL 上述Pyr 乙醇溶液，再缓慢滴加5 mL 六水合硝酸锌水溶液 (7.44 × 104μg/mL) 。反应体系在室温下磁力搅拌 (600 r/min) 15 min后，在10 000 r/min 下离心15 min，沉淀用无水乙醇清洗(10 mL × 3 次)，30 ℃真空干燥得到Pyr@ZIF-8 样品。

1.3 Pyr@ZIF-8 的表征

1.3.1 粒径和Zeta 电位测定以及外观形貌表征 通过马尔文激光粒度仪测定样品粒径分布和Zeta 电位。分别将上述10 000 μg/mL 的Pyr 乙醇溶液、30%Pyr 乳油、Pyr@ZIF-8 和ZIF-8 分散于水中，使其最终质量浓度均为500 μg/mL。转入石英比色皿中，测试其粒径分布和Zeta 电位。通过扫描电镜观察样品的形态外貌。取适量干燥的Pyr@ZIF-8 样品粉末固定在导电胶上，设定加速电压为3.00 kV，工作距离为5.5 mm，观察其形态特征。

1.3.2 红外光谱分析 通过FTIR 对Pyr 原药、ZIF-8 和Pyr@ZIF-8 等样品化学官能团的变化进行分析。取少许样品粉末与约300 倍干燥的KBr 粉末混合研磨3～5 min 后压片，在4000～500 cm−1的波数范围内进行红外检测。

1.3.3 热重分析 通过热重分析(TGA)测定样品的热稳定性。分别称取Pyr 原药、ZIF-8 和Pyr@ZIF-8的干燥粉末置于样品坩埚中，在0～800 ℃的范围内进行热重分析，以分析不同样品的热稳定性差异。

1.3.4 X 射线粉末衍射表征 通过X 射线粉末衍射(XRD)分析样品晶型的变化。称取适量Pyr 原药、ZIF-8 和Pyr@ZIF-8 干燥粉末，分别平铺在样品台上，扫描速率为2°/min，衍射角扫描范围为3°～80°。

1.4 载药率与释放性能测试

1.4.1 吡唑醚菌酯标准曲线测定 先称取5.0 mg Pyr 原药，用甲醇溶解并定容至5 mL，得到质量浓度为1000 μg/mL 的Pyr 甲醇溶液；再依次将其稀释成500、250、125、62.5 和31.25 μg/mL 的系列标准溶液，用高效液相色谱 (HPLC) 测试样品的峰面积。色谱条件：流动相为V(甲醇) :V(水) =80 : 20，检测波长为275 nm，进样量20 μL，流速1 mL/min，柱温30 ℃。

1.4.2 Pyr@ZIF-8 载药率测定 称取3.0 mg Pyr@ZIF-8，分散于3 mL 甲醇中，加入3 μL 浓盐酸，溶解后吸取1 mL 上清液，用HPLC 测定Pyr 的浓度。按式 (1) 计算载药率。

其中：LC为载药量，%；mPyr为Pyr@ZIF-8中Pyr 的质量，mg；mPyr@ZIF-8为Pyr@ZIF-8 的总质量，mg。

1.4.3 Pyr@ZIF-8 释放性能测定 称取2.8 mg Pyr@ZIF-8，分别分散于3 mL 0.01 mol/L 的PBS(pH = 4.0、6.0、8.0)缓冲液中，配制成Pyr 质量浓度为100 μg/mL 的Pyr@ZIF-8 悬浮液。静置24 h 后离心取上清液，用HPLC 测试释放出来的Pyr 的质量。通过式 (2) 计算累计释放率。

其中：Rc为累计释放率；m24为Pyr@ZIF-8 24 h 的Pyr 释放量，mg；m0为Pyr@ZIF-8 中Pyr 的总质量，mg。

1.5 Pyr@ZIF-8 光稳定性测试

称取0.3 mgPyr 原药溶解于30 mL 乙醇中，称取2.8 mg Pyr@ZIF-8 分散于30 mL 乙醇中。将Pyr 乙醇溶液分装到19 个离心管中，每个离心管内1 mL。Pyr@ZIF-8 操作同Pyr 原药。将离心管放入245 nm 紫外光下照射，样品距离光源15 cm。每隔10 min 取样，加入3 μL 浓盐酸，溶解后吸取1 mL，用HPLC 测定溶液中的Pyr 浓度。通过式 (3) 计算降解率(RD)。

其中：mt为Pyr@ZIF-8 中Pyr 在th 时的剩余质量，mg；m0为Pyr@ZIF-8 中Pyr 的总质量，mg。

1.6 体外生物活性测定

1.6.1 离体抑菌活性测定 采用菌丝生长速率法[34]：称取0.025 g (精确到0.0001 g)待测化合物，用2.50 mL 含1%吐温-20 的丙酮溶液溶解，配制成质量浓度为10 000 μg/mL 的母液。各取母液适量加入PDA 培养基中，制作为含药培养基，Pyr 的质量浓度为0.1 μg/mL。取直径为6.00 mm的油菜菌核病菌菌饼，接种至含药培养基中。每处理3 次重复。以仅用丙酮溶液处理过的菌饼为空白对照，于(25 ± 2) ℃下培养2 d 后用十字交叉法测量菌落直径。通过式 (4) 计算抑菌率。

其中：I为菌丝生长抑制率，%；dt为处理组菌丝生长直径，cm；dc为对照组菌丝生长直径，cm。

1.6.2 盆栽试验 使用敏感型油菜测试Pyr@ZIF-8 对油菜菌核病的防治效果[35]。在两周大的健康油菜叶上均匀喷洒Pyr@ZIF-8 (5 mL 水溶液，Pyr 的质量浓度为100 μg/mL) ，室温下自然晾干后，立即接种油菜菌核病菌作为0 d 处理，7 d 后接种该病菌作为7 d 处理。以喷施清水的油菜作为空白对照，喷施同等药物浓度的Pyr 乳油水溶液作为阳性对照，喷施量以叶片全部润湿为止，也为5 mL。接种油菜菌核病菌后培养36 h 观察并测量病斑直径，每个处理3 次重复。通过式 (5) 计算防治效果。

其中：E为防治效果，%；Dt为处理组病斑直径，cm；Dc为对照组病斑直径，cm。

2 结果与讨论

2.1 纳米颗粒的形貌表征

图1 (a) 为Pyr@ZIF-8 纳米颗粒的扫描电子显微镜照片，可见Pyr@ZIF-8 晶体形状规则，晶粒大小分布较均匀，粒径在100 nm 左右，表面光滑且颗粒之间略有团聚现象。图1 (b) 为使用马尔文激光粒度仪测定的不同样品的动态光散射粒径分布图，Pyr@ZIF-8 的平均粒径约为143.1 nm，高于扫描电子显微镜所统计粒径大小，这与马尔文激光粒度仪测得的颗粒粒径为纳米颗粒的水合粒径 (流体动力学粒径) 有关[36]。此外，还可观察到Pyr@ZIF-8 与纳米载体ZIF-8 的粒径无明显差异，表明Pyr 的负载对纳米载体的粒径无影响。而相比于商品化乳油制剂，Pyr@ZIF-8 的粒径有所降低，证明在不借助于其他有机溶剂与表面活性剂情况下，通过此方法可有效降低原药的粒径。

图1 Pyr@ZIF-8 的扫描电镜图(a) 以及Pyr 乳油、Pyr@ZIF-8 和ZIF-8 的粒径分布图(b)Fig. 1 SEM of Pyr@ZIF-8 (a) and particle size distribution of Pyr EC, Pyr@ZIF-8 and ZIF-8 (b)

2.2 纳米颗粒的红外光谱

测试结果如图2 所示。在ZIF-8的红外谱图中，在3177 cm−1和2927 cm−1处的吸收峰分别为咪唑环和甲基中的C－H 伸缩振动吸收峰，1566 cm−1处的特征峰归属于C=N 伸缩振动峰，1146和995 cm−1为C－N 的伸缩振动特征峰，这均与文献报道一致[37]，证明本研究成功合成了ZIF-8 纳米颗粒；在Pyr 原药的红外谱图中，与苯环缔合的C=O 伸缩振动峰为1716 cm−1，苯环骨架的伸缩振动峰分别为1599、1549、1506 和1481 cm−1等[38]；而在Pyr@ZIF-8 的红外谱图中，可以同时观察到ZIF-8 纳米载体3177 和2927 cm−1处与Pyr 的1716、1599、1549、1506 cm−1等特征吸收峰，且未出现新的特征峰，证明Pyr 主要以物理作用被ZIF-8 负载。

图2 Pyr、ZIF-8 及Pyr@ZIF-8 的FTIR 谱图Fig. 2 FTIR spectra of Pyr, ZIF-8 and Pyr@ZIF-8

2.3 纳米颗粒的X 射线粉末衍射分析

图3 为Pyr@ZIF-8、ZIF-8 和Pyr 原药的XRD 谱图。从ZIF-8 的XRD 谱图可以看出，合成样品的XRD 图谱与文献报道的ZIF-8 标准谱图的衍射峰一致[39]，即 (011) 、 (002) 、 (112) 、 (022) 、(013) 和 (222) ，表明通过本研究方法可以得到高结晶度的ZIF-8 材料。通过对比ZIF-8 与Pyr@ZIF-8的谱图，可以看出两者的特征衍射峰位置基本一致。结合红外测试的结果，说明吡唑醚菌酯主要通过物理作用负载到了ZIF-8 内部。

图3 Pyr、ZIF-8 及Pyr@ZIF-8 的XRD 谱图Fig. 3 XRD spectra of Pyr, ZIF-8 and Pyr@ZIF-8

2.4 纳米颗粒的热重分析

热重分析主要用于分析材料的热稳定性和分解行为。图4 是Pyr、ZIF-8 和Pyr@ZIF-8 在室温升温到800 ℃时的失重曲线。在200 ℃之前所有样品都发生了不同程度的失重，可能是由于样品中水分蒸发而引起的损失，其中ZIF-8 在200 ℃时有一个较为明显的失重趋势，这是由于ZIF-8材料空腔或表面溶剂分子挥发所致[39]。升温到200～600 ℃时，ZIF-8 质量下降，这主要是由于表面的有机配体碳化导致；Pyr 在250～300 ℃几乎完全分解；Pyr@ZIF-8 在相同温度范围内，则下降趋势较缓，说明ZIF-8 对Pyr 具有一定的保护作用，增强了农药的热稳定性。当升温至600 ℃时，Pyr@ZIF-8 失重，推测是由材料骨架的坍塌分解导致的。

图4 Pyr、ZIF-8 和Pyr@ZIF-8 的TGA 图Fig. 4 Thermogravimetric analysis (TGA) curves of Pyr,ZIF-8 and Pyr@ZIF-8

2.5 纳米颗粒的Zeta 电位分析

图5 是不同样品的Zeta 电位谱图。ZIF-8 的Zeta 电位为28.1 mV，Pyr 原药的Zeta 电位为−34.9 mV，说明Pyr 可以通过静电作用负载到载体ZIF-8 中。叶片表面一般由带负电荷的高级脂肪酸、脂肪醛与脂肪醇构成[40]，Pyr@ZIF-8 经电荷转化呈正电性，更有利于在叶片上黏附。Pyr@ZIF-8 的Zeta 电位相比于ZIF-8，只有小幅度下降，这可能与Pyr 的负载量较小有关；而Pyr 乳油的Zeta 电位为 −36.2 mV，与Pyr 原药接近，说明此乳油制剂没有改变Pyr 原药的电负性。

图5 Pyr、Pyr 乳油、ZIF-8 及Pyr@ZIF-8 的Zeta 电位变化Fig. 5 Zeta potential curves of Pyr, Pyr 300EC,ZIF-8 and Pyr@ZIF-8

2.6 纳米颗粒的释放性能分析

根据HPLC 测试得到Pyr 的标准曲线为y=75186x+ 221361 (R2= 0.999) ，Pyr@ZIF-8 的载药率为10.8%。通过考察Pyr@ZIF-8 在pH 值为4.0、6.0、8.0 时Pyr 的释放率，探究了载体的酸敏感性。从图6 中可以看出：在不同pH 条件下，Pyr 均可以释放，但在酸性条件下释放率更高。在pH 值为4.0、6.0、8.0 时，24 h 时Pyr@ZIF-8 中Pyr 的释放率分别为88.1% ± 2.5%、67.3% ±3.1%和25.6% ± 2.9%，表明Pyr@ZIF-8 具有pH响应释放特性。

图6 Pyr@ZIF-8 在不同pH 下24 h 后的释放率Fig. 6 Pyr@ZIF-8 release rates after 24 hours at different pH values

2.7 纳米颗粒的光稳定性

从图7 中可以看出：Pyr 原药在紫外光照射10、20 和30 min 时降解率分别达71.4%、96.6%和99.6%；而同样条件下Pyr@ZIF-8 的降解率分别为67.4%、82.8%和93.7%。将Pyr 负载到ZIF-8 后，在30 min 的紫外光照下，降解率降低了6.2%。这可能是由于载体ZIF-8 具有紫外光吸收能力[15]，因此ZIF-8 对于Pyr 具有一定的保护能力，可以提高其光稳定性。

图7 Pyr@ZIF-8 和Pyr 在245 nm 紫外光照射下的降解率Fig. 7 Degradation rates of Pyr@ZIF-8 and Pyr under 245 nm UV irradiation

2.8 生物活性

采用菌丝生长速率法测定了Pyr 和Pyr@ZIF-8 对油菜菌核病菌的抑制效果。从表1 中可以看出，在有效成分质量浓度为0.1 μg/mL 的条件下，Pyr@ZIF-8 对油菜菌核病菌的抑制率为59.3% ±8.6%，比Pyr 原药提高了16.4%。盆栽试验结果(图8a、8b) 表明：与空白对照相比，在喷施药剂(有效成分质量浓度均为100 μg/mL)后1 h 接种油菜菌核病菌的情况下，分别用Pyr 乳油和Pyr@ZIF-8 处理的油菜叶片病斑面积均很小；处理7 d 后接菌的情况下，Pyr@ZIF-8 对油菜菌核病的防治效果为80.2% ± 8.6%，比Pyr 乳油对照处理 (抑制率为70.8% ± 5.9%) 提高了9.4%，说明Pyr@ZIF-8 防治油菜菌核病具有更好的持效性。

表1 吡唑醚菌酯载药纳米颗粒对油菜菌核病菌的抑菌活性Table 1 Fungicidal activity of Pyr and Pyr@ZIF-8 against Sclerotinia sclerotiorum

图8 Pyr@ZIF-8 和Pyr 乳油在100 μg/mL 下对油菜菌核病的盆栽试验防治效果( 0 d 和7 d)(b 图中不同字母表示经Duncan 氏新复极差法检验在0.05 水平差异显著)Fig. 8 Control efficacy of Pyr@ZIF-8 and Pyr EC against Sclerotinia disease on pot experiments at 100 μg/mL (0 d and 7 d)(Different letters in the Fig. 8b indicate that the difference is significant at the level of 0.05 by Duncan's new complex difference method)

3 结论

本研究通过 “一锅法” 将吡唑醚菌酯封装在沸石咪唑酯骨架材料ZIF-8 纳米颗粒中，制备得到了pH 响应性吡唑醚菌酯控释剂Pyr@ZIF-8，其表面呈光滑的晶体形状，平均粒径为143.1 nm，呈正电性。吡唑醚菌酯主要通过静电作用负载到ZIF-8 载体内部，并受到载体的保护，其热稳定性和抗紫外光解性能均有所改善。控释试验表明，Pyr@ZIF-8 具有明显的pH 响应释放性能，可在酸性环境下使ZIF-8 纳米颗粒塌陷，释放出吡唑醚菌酯。与吡唑醚菌酯原药和商品化乳油制剂相比，Pyr@ZIF-8 具有良好的热稳定性、抗光解性和更优异的生物活性和缓释性能。目前本研究仅处于探索发展阶段，后续可通过控制粒径、提高农药负载率和叶面黏附性等方面进一步提高ZIF-8 的性能，使此类金属有机骨架(MOFs)多孔材料作为有效的环境响应性纳米载体更好地应用于作物病害控缓释，这些研究结果对于后续开发构建智能缓控释农药新制剂具有重要参考价值。