D-甲硫氨酸通过降低环二鸟苷酸清除牙龈卟啉单胞菌生物膜

牙周炎和种植体周围炎是天然牙和种植体脱落的主要原因，其始动因素主要为菌斑生物膜的堆积，致病菌包括牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌等

。牙龈卟啉单胞菌可释放多种毒力因子，如脂多糖、牙龈蛋白酶、肽聚糖、菌毛和凝血酶等，刺激宿主的先天免疫反应

。另外牙龈卟啉单胞菌还可直接刺激其他类型细胞，显著上调细胞的炎症因子分泌，表现为典型的炎症状态

。

基于上述情况，本研究提出一种新的对菌液浓度的表示方法，利用图像检测方法[6]提取到的颜色特征值通过实验得到菌体生长期间数量变化时菌液浑浊度的改变与颜色特征值的关系，为以后对符合要求的菌体设定合适的阈值自动检测筛选提供基础.

自然界中细菌多数情况下以生物膜形式存在，附着于组织表面，并通过自分泌的细胞外基质，如胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）、蛋白质和环境DNA（e-DNA），将自身包裹其中，对抗环境压力

。研究表明生物膜状态下牙龈卟啉单胞菌等致病菌的致病性大约是浮游状态下细菌的500倍

。

特定D-氨基酸可抑制某些细菌生物膜的形成。例如，枯草芽孢杆菌可产生D-甲硫氨酸（D-Methionine，D-Met）、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-亮氨酸的混合物，防止生物膜的过度形成

；25 mmol/L的D-Met可显著抑制与根管治疗后持续感染相关的粪肠球菌生物膜的形成

。笔者课题组前期研究发现，与单种D-氨基酸相比，D-精氨酸、D-Met和D-组氨酸的联用增强了单种D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的清除作用

。另外，牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌等在牙周组织中产生硫化物及蛋白代谢过程也与利用甲硫氨酸有关

。但是，D-Met对牙龈卟啉单胞菌生物膜影响的具体机制尚不清楚。本试验拟初步探讨D-Met通过影响环二鸟苷酸（cyclic diguanosine monophosphate，c-di-GMP）清除牙龈卟啉单胞菌生物膜的作用机制。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

主要材料与试剂：牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277（ATCC，美国）；小鼠成纤维细胞L929（ATCC，美国）；BHI 培养基、DMEM 高糖培养基（索莱宝，中国）；c-di-GMP、D-Met（Sigma，美国）；哥伦比亚血琼脂培养基（上海申启，中国）；牛脑心浸液培养基（青岛海博，中国）；胎牛血清（Thermo Fisher，美国）；0.1%结晶紫（北京酷来博，中国）；CCK-8试剂（Dojindo，日本）；乙酸铵、100%甲醇（北京瑞康，中国）；苯酚（上海研生，中国）。

1.2.3 D-Met 对牙龈卟啉单胞菌生物膜生物量及胞外多糖的影响 ①生物膜形成抑制实验：细菌培养同上，对照组加入0 mmol/L D-Met，实验组加入不同浓度D-Met（5、10、15、20、25、30、35 mmol/L），37 ℃厌氧孵育3 d。以结晶紫染色法评估牙龈卟啉单胞菌生物膜形成过程中的生物量，即PBS 冲洗3 次，室温干燥20 min，加入37%多聚甲醛，固定15 min，PBS 冲洗，加入0.1%结晶紫染液，室温20 min，PBS 冲洗，加入乙醇（95%），20 min 后转板，测定吸光度值（OD

）；以苯酚-硫酸法（OD

）测定牙龈卟啉单胞菌生物膜形成过程中胞外多糖含量，采用无水葡萄糖绘制标准曲线。②成熟生物膜裂解实验：37 ℃厌氧孵育3 d 形成成熟生物膜后，每组分别加入不同浓度D-Met（20、25、30、35 mmol/L），继续厌氧孵育3 d，以上述同样的方法测定牙龈卟啉单胞菌生物膜生物量及胞外多糖量。

1.2.4 扫描电镜观察牙龈卟啉单胞菌生物膜形态的变化 生物膜形成抑制及成熟生物膜裂解的实验过程及分组同上。PBS 冲洗3 次，2.5%戊二醛固定过夜（4 ℃）。乙醇梯度脱水（各10 min），烘干，喷金，采用扫描电镜观察生物膜形态。

1.2 实验方法

1.2.1 D-Met 对小鼠成纤维细胞L929 增殖的影响 将D-Met 以梯度浓度（5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol/L）溶解于细菌培养基中，使用0.22 μm滤膜进行过滤灭菌。取100 μL 小鼠成纤维细胞（L929），复苏消化后用含10%胎牛血清的DMEM培养基配成细胞浓度为5.0 × 10

个/mL，培养24 h后，实验组加入含不同浓度D-Met的培养基100 μL，对照组加入等体积的DMEM 培养基，每天更换培养基。分别在第1、3、5 天，加入CCK-8 试剂，避光37 ℃孵育4 h。酶标仪检测450 nm 吸光度值（optical density，OD），计算各组细胞的增殖活力。

1.2.2 D-Met 对牙龈卟啉单胞菌细菌活性的影响 复苏牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277，于BHI 液体培养基37 ℃厌氧培养至对数生长期，将菌液浓度调整为1.0 × 10

CFU/mL，接种于含不同浓度DMet 的BHI 液体培养基，对照组为不含D-Met 的BHI 液体培养基，每4 h 检测其吸光度值，持续至72 h，评估最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）；取高于MIC 实验组孵育3 d，以菌落生长情况评估最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

政府是消除贫困的主体，具有强大的政治优势和资源动员能力，是我国扶贫攻坚取得成功的关键。通过“当地政府主导、人民银行牵头、金融机构参与”的组织形式，建立多部门联动机制，实现资源联结，弥补单靠政府或仅依靠金融机构实施金融精准扶贫的弊端，解决易地扶贫搬迁后续扶持金融服务工作的政策保障、资源整合、信贷支持、精准匹配以及风险分担等问题。

主要仪器：恒温细胞培养箱（BB15，Thermo，美国）；酶标检测仪（synergy HT，Bio-TEK，美国）；低温离心机（5810R，Eppendorf，德国）；扫描电子显微镜（S-4800，Hitachi，日本）；透射电子显微镜（（JEM 1400 PLUS，JEOL，美国）；高效液相色谱仪（Waters 1525，Waters，美国）。

低收入家庭在获得住房救助方面，主要是获得住房改造补贴，占比18.2%，且主要集中在农村地区；获得廉租房/公租房的比例为8.9%，主要集中在中心城市、城乡郊区城乡结合部以及县城和建制镇；仅有0.2%的低收入家庭获得经济适用房/限价房。这跟低收入家庭住房来源密切相关，农村地区低收入家庭主要居住自建房，获取住房改造补贴较多，而中心城市居住租赁房较多，购房比例较少，因此获取廉租房/公租房的较多。值得留意的是，低收入家庭购买经济适用房/限价房的比例极低，即使房价比市场价更低，但是并没有因房价的降低而缩小低收入家庭自身资本与房价之间的差距。

在L929 细胞增殖第1、3、5 天，与对照组相比，5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L D-Met 组细胞活力差异无统计学意义（

＞0.05）；45 mmol/L D-Met组吸光度值低于对照组（第1 天：

＝0.046，第3 天：

＜0.001，第5 天：

＜0.001）（图1a）。各组牙龈卟啉单胞菌生长曲线在28～36 h 时达到峰值，与对照组相比，当D-Met ≥35 mmol/L 时，L929 细胞的生长曲线平缓，无明显对数期，即35 mmol/L D-Met 为MIC（图1b）；在40 mmol/L D-Met 组，琼脂板上无菌落生长，即40 mmol/L D-Met 为MBC（图1c）。

孕妇去户外运动，阳光中的紫外线为身体制造出了活化的维生素D3，它可以促进体内钙、磷的吸收和利用。既有利于宝宝骨骼的发育，又可防止孕妈妈发生骨质疏松。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件分析数据，采用方差分析（ANOVA）检验各组间差异，以

＜0.05 为差异具有统计学意义，用Graphpad Prism7 绘制曲线。

2 结 果

2.1 D-Met 对L929 细胞增殖及牙龈卟啉单胞菌细菌活性的影响

1.2.5 牙龈卟啉单胞菌细胞膜完整性的变化 生物膜形成抑制及成熟生物膜裂解的实验过程同上，分组为对照组和35 mmol/L D-Met 组。收集生物膜后置于离心机中，4 000 rpm 离心10 min（4 ℃）。2.5%戊二醛固定1 h，1%四氧化锇固定1 h，PBS 洗涤4 次，乙醇梯度和丙酮脱水，树脂包裹后行切片，3%醋酸铀和柠檬酸铅对切片进行双染色。采用透射电镜观察生物膜中细胞膜完整性的变化。

2.2 D-Met 对牙龈卟啉单胞菌生物膜生物量及胞外多糖的影响

在生物膜形成抑制实验及成熟生物膜裂解实验中，D-Met ≥20 mmol/L 时，生物膜生物量低于对照组（图2a-2b）；图2c 为标准葡萄糖曲线；D-Met ≥20 mmol/L 时同样能抑制生物膜形成时胞外多糖的产生（图2d），以及促进成熟生物膜中胞外多糖的消散，呈浓度依赖性（图2e）。

2.3 D-Met 对牙龈卟啉单胞菌生物膜形态的影响

红色复合体是一群与牙周病显著相关的病原体，包括牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛类杆菌

。它们与宿主组织接触，介导大量炎性趋化因子、细胞因子释放，导致牙周/种植体周围结构破坏

。由于细菌多数以生物膜的形式存在，细胞外基质对细菌的包裹作用以及细菌间的群体感应效应导致传统的抗菌药物往往无法有效对抗感染部位的生物膜

。

2.4 D-Met 对牙龈卟啉单胞菌细胞膜完整性的影响

对照组中细胞的形状规则，细胞壁完整，细胞中染色颗粒稀少；相反，在生物膜形成抑制实验中，35 mmol/L D-Met 使细胞膜破裂，细胞中的内容物通过细胞膜上的裂孔溢出；而在成熟生物膜裂解实验中，35 mmol/L D-Met 组中细胞内容物深染，大量细胞内染色颗粒表明膜通透性增加，大量染色剂渗入细胞内基质中，见图4。

1.2.6 D-Met 对牙龈卟啉单胞菌生物膜内c-di-GMP的影响 生物膜形成抑制及成熟生物膜裂解的实验过程同上，分组同1.2.4。c-di-GMP 的提取：超声生物膜培养物10 s，获得混悬液，测定吸光度（OD

），离心（16 000 g，2 min，4 ℃），弃上清液。PBS 洗涤沉淀（16 000 g，2 min，4 ℃），弃上清液。沉淀物加入PBS，100 ℃下水浴5 min。加入冰乙醇使最终乙醇浓度为65%，萃取15 s。离心样本（16 000 g，2 min，4 ℃），保留上清液。使用剩余沉淀重复上述步骤2 次，混合上清液。使用真空浓缩蒸发器干燥上清液，获得含有c-di-GMP 的粉末状样品。c-di-GMP的检测：将c-di-GMP样品溶解于1 mL无菌蒸馏水，使用Waters 1525 高效液相色谱仪检测及分析c-di-GMP 的含量，使用商品化c-di-GMP绘制标准曲线。

2.5 D-Met 对牙龈卟啉单胞菌生物膜内c-di-GMP的影响

图5a为c-di-GMP的标准曲线；在生物膜形成抑制实验及成熟生物膜裂解实验中，与对照组相比，D-Met ≥20 mmol/L 时可明显降低生物膜内c-di-GMP的含量（

＜0.05），且呈浓度依赖性，见图5b-e。

3 讨 论

在生物膜形成抑制实验中，扫描电镜下可见，对照组的生物膜致密且多层，细胞外基质形成网状结构。20、25、30 mmol/L 组中的细菌密度减低，细菌通过稀疏的细胞外基质连接，35 mmol/L 组生物膜完整性彻底消失，细胞膜出现破裂（图3a）。在成熟生物膜裂解实验中，生物膜的密度随着DMet 浓度的增加呈下降趋势；尤其是35 mmol/L 组细胞外基质完全缺失，细胞表面变得更光滑，没有可见的细胞外附属器（图3b）。

积雪在短时间内不同时相高分四号卫星近红外图像上均表现为稳定的强反射特征，而同一区域不同时相的云层受到成分、厚度、高度等因素影响，其反射值会出现波动.因此，在基于多时相全色图像得到的雪盖范围内，针对高分四号卫星近红外波段图像，进行多时相近红外图像的最小值合成.结合积雪在近红外波段的高反射特征，通过二值化分割，取亮度值不小于0.9倍动态范围值的像元为雪.由于这是在全色图像上提取积雪范围的基础上进行的再处理，因此，采用基于动态范围的相对阈值作为门限值，就可进一步消除变化云层因素的影响，计算方法如下：

作为细菌内源性的固有成分，D-氨基酸在对抗微生物生物膜方面与传统药物有本质的区别。D-氨基酸可由细菌自身产生，主动触发生物膜的分散，而分散的游离菌可定植到新的部位再次形成生物膜，以实现适应营养物质耗尽的不利环境

。因此，D-氨基酸不仅是细菌自身适应微环境改变的一种生存策略，也为生物膜的清除提供了一种新的思路。霍乱弧菌能够分泌大量的D-精氨酸，以调整生物膜及细菌细胞膜的完整性

。Tong 等

研究发现，外源性加入40 mmol/L 的D/L-半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸均可显著抑制变异链球菌生物膜的形成。本实验中，D-Met 浓度高于20 mmol/L 显著抑制了牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成并有效分散了成熟的生物膜，且最为显著的是，35 mmol/L D-Met 完全消除了细胞膜外附属器的产生，提示D-Met 可能通过特定机制影响了牙龈卟啉单胞菌的合成代谢。另外，D-Met 的浓度高于20 mmol/L 显著降低了生物膜中EPS 的生物量。D-酪氨酸在低浓度时可促进铜绿卟啉单胞菌EPS 的产生，而在高浓度时则导致EPS 的减少

，与本实验结果相似。因此，EPS 可能同样受到D-Met 参与调控合成代谢的影响。

c-di-GMP 作为第二信使，普遍存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中，是细菌生物代谢的关键调控因子，包括多糖及蛋白的生物合成、细菌运动性和毒力等

。高浓度的c-di-GMP 可以促进生物膜的形成，而低浓度的c-di-GMP 可以抑制生物膜的形成

。在费氏弧菌中，Ca

可激活二胍基酸环化酶，从而促进合成c-di-GMP，导致细菌的运动性降低而纤维素的合成增加

。c-di-GMP G-四联体诱导剂可诱导c-di-GMP 形成四联体，从而干扰了cdi-GMP 正常的生物功能，包括细菌运动和胞外多糖的分泌，导致生物膜形成受阻

。与之相似，本实验中D-Met 浓度高于20 mmol/L 显著降低了牙龈卟啉单胞菌c-di-GMP 的水平，尤其在35 mmol/L时，c-di-GMP 的表达水平下降至最低。综上，牙龈卟啉单胞菌生物膜生物量、EPS 产生、生物膜形态、细胞膜完整性均与c-di-GMP 的变化趋势协同一致，基于此，笔者推测D-Met 可能通过降低c-di-GMP 水平抑制和分散牙龈卟啉单胞菌生物膜。

本研究通过生物膜及胞外多糖的生物量、生物膜及细胞膜的微观形态以及c-di-GMP 的蛋白水平首次揭示了D-Met 可能通过作用于c-di-GMP 从而抑制和分散牙龈卟啉单胞菌生物膜的机理。但是c-di-GMP 表达受抑制的分子机制以及其上游/下游信号通路仍需进一步验证。

鱼腥草中的挥发油成分能对动物细胞中白细胞的吞噬作用进行强化，提升动物血清解毒的作用，进而增强动物的免疫力，这在动物肺炎、动物器官性疾病防治中的应用较多，效果也比较显著。

Xie LL and Zhang HY performed the experiments and wrote the article. Wang ZX， Li BR and Li Z performed the experiments. Meng WY designed the study and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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