脑膜瘤组织中组织蛋白酶异常表达及其诊断价值研究

李立，谭超华，周灿宦，蔡晓燕

台山市人民医院 病理科，广东 台山 529200

0 引言

脑膜瘤是颅内常见性肿瘤，于所有颅内原发肿瘤中占24%左右。脑肿瘤所体现的生物学特点是附近脑内侵袭早期肿瘤细胞，整个环节与组织蛋白酶具有相关性，蛋白酶也被作为诊断标记恶性肿瘤的记号[1]。脑膜瘤多数均是良性生长，恶性脑膜瘤和非典型于全部脑膜瘤中占据10%，其侵袭性较多，即使采用手术切除，10年内的复发率也依然高达15%，不典型的恶性肿瘤切除后5年内即为复发，且高达78%。鉴别良恶性的方式众多，当下尚无预测因子、生化标记来区分良恶性。组织蛋白酶B（cathepsin B，Cat B）经内源性抑制因子调整，在半胱氨酸蛋白酶超家族中有一席之地，参与肿瘤的浸润与转移，能够对细胞外基质发挥良好的降解作用[2]。文章主要分析脑膜瘤Cat B的表达水平，探索其与酶抑制因子之间的关系，研究其在良恶性区分中的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018年1月-2020年1月本院取100例脑膜瘤患者肿瘤组织标本，男女均50例，年龄20～73岁，平均（54.5±3.6）岁；矢状窦旁26例，大脑凸面34例，颅底脑膜瘤40例。全部标本均安排经验丰富的医师独立对其重新归类和分析。所有参与的患者均知情自愿参与研究。此次研究已获得本院伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 分析组织学

选择具有代表性的肿瘤组织制为4μm厚石蜡切片，染色用[苏木素-伊红（H.E）]，免疫标记为Cat B、胱抑素（cystatins，Cys）。结合肿瘤分级标准对肿瘤分类，良、恶性与非典型性。

1.2.2 分析免疫组化

用广州提供的试剂盒展开操作。依据试剂盒步骤执行，固定4%多聚甲醛，包埋石蜡，连续切片，厚度4μm，常规脱蜡用水，取双氧水甲醇液（3%），在室温下20min消除内源性过氧化物酶，在枸橼酸缓冲液0.01mol/L缓冲液中进行10min高压修复，正常山羊血清10%密闭10min，在37℃下，依次加入1:100兔抗人CatB抗体孵育2h，生物素化标记二抗工作液30min，辣根酶标注的SP工作液30min。DAB显色，苏木素复染。每次研究同时用PBS替换一抗为阴性对抗，Cat B阳性是棕色。

1.2.3 免疫组化评分

肿瘤细胞免疫标注的强度与频率能够综合评估抑制剂A（stefin A）、胱抑素C（cystatin C），评分遵循组织化学评分标准，分值0～3分。人体细胞中Cat B反应频率为阳性者记分为：评分以染色阳性肿瘤细胞占比为主，0分不存在；1分30%以下；2分30%～60%；3分60%以上；染色强度依据阴性、弱、中、强级别计为0、1、2、3[3]。取肿瘤细胞中CatB染色数据划分为两组，弱阳性小组：0～3分；强阳性组：4～6分。因染色强度过低，没有评估Stefin A、Cystatin C染色。

1.3 统计学分析

按均值、频度、卡方检验处理数据，P＜0.05表示组间差异显著。

2 结果

2.1 CatB于脑膜瘤中免疫组化胞内定位

CatB阳性表现：细胞质呈棕色，脑膜瘤细胞较深的是中棕色，以颗粒状呈现，于胞质中分布，胞核、胞膜均为阴性。见图1。

图1 脑膜瘤组织中Cat B 表达免疫组织化学

2.2 不同位置脑膜瘤Cat B表达

全部脑膜瘤中，矢状窦旁26例，大脑凸面34例，颅底脑膜瘤40例。其中，非典型性脑膜瘤、恶性脑膜瘤均处于矢状窦旁、大脑凸面，颅底脑膜瘤中未出现非典型性、恶性脑膜瘤。Cat B于其中免疫组化高积分百分率分布为59%、69%、29%。经统计学分析，矢状窦旁脑膜瘤与大脑凸面脑膜瘤差异不显著（P＞0.05）。但矢状窦旁脑膜瘤与大脑凸面脑膜瘤和颅底脑膜瘤比较，差异较大（P＜0.05）。

3 讨论

脑膜瘤是颅内经常出现的肿瘤，一般呈良性。治疗时因对化疗和放疗敏感度低下，最有效的治疗方式当属手术切除。但利用手术治疗，很容易复发。当前尚未发现一类临床与组织血标记物有效对疾病预后与分级进行评估，部分脑膜瘤于机体形态中枢中为良性，但临床侵袭性较强。术后复发的原因是脑膜瘤侵袭性行为，患者长时间备受影响，无形中会使患者致残和死亡。实践发现，部分肿瘤可划分在恶性瘤体中，需为患者支撑疗法与短时间内随访。但部分肿瘤多数未得到认识，由于既往常以此评判肿瘤级别，外科手术中比较匮乏，处于正常脑组织界面中，这一界面是考察肿瘤是否存在侵袭的主要因素。不完全对瘤体的切除很容易导致肿瘤重复出现[4]。有时，以往的良性肿瘤复发时时而会有恶性特点，这一情况说明，肿瘤由良性向侵袭性发展的环节比较漫长，有必要探索全新的指标来区分肿瘤的发展。

脑膜瘤具有一定的侵袭性，肿瘤在侵袭时必须满足三个条件，分别是黏附性、蛋白水解酶、细胞间黏附能力，这主要与黏附分子的不足相关。很多恶性脑膜瘤经对特异性整合素的表达以同分异构体表现，但不会表达E-钙粘连素，细胞黏附性可迅速降低，侵袭性会增强。人体的基因产物在丢失后，蛋白会使得细胞丢失黏附能力。所以，涉及细胞接触与细胞黏附不同蛋白-细胞骨架肌动蛋白、膜蛋白。虽然蛋白看起来有桥梁作用，但细胞黏附性不足会促进肿瘤的进一步浸润和增殖。另外参与的肿瘤侵袭因子，细胞外基质蛋白水解酶包含的酶较多。抑制因子的调节主要和诸多肿瘤恶化相关，但活性良性与不典型的脑膜瘤高于恶性，这说明肿瘤的侵袭性行为与恶性进展相关。有学者认为，很多存在骨质增生的脑膜瘤病理在检查时可发现肿瘤骨侵犯。还有学者表示，局部骨质增生主要是激活肿瘤酶的结果，会使细胞的活化增殖加快，伴骨质增生的脑膜瘤表达会上升。同理可得，肿瘤细胞分泌的体液因子可对骨细胞活化造成刺激，主要与脑膜瘤的骨质增生相关。

当前，还没有组织血标志物，科学对病理分级与预后进行评估，部分脑膜瘤于组织形态可划分到良性中，但临床上具有较高侵袭性。脑膜瘤侵袭行为是术后复发的主要因素，不仅会对患者的预后造成影响，还容易致残和致死。既往对肿瘤级别的评判中缺乏脑肿瘤与正常脑组织间界面，此界面对肿瘤是否具备侵袭性极为重要，和完全切除相比，脑膜瘤不完全切除更容易复发。以往的良性肿瘤复发时可发现恶性特点，这说明肿瘤会从良性发展到侵袭性再到恶性，整个过程较慢，需寻找全新的预示脑膜瘤进程的生物学指标。

脑肿瘤主要的表现特点是部分浸润和初期肿瘤细胞浸润大脑，这和金属蛋白酶水平相关，因为蛋白酶经常作为诊断恶性脑膜瘤的标记。部分研究展现，组织蛋白酶与肿瘤进展密切，其主要是内源性抑制因子家族有三个，细胞外发挥作用的是Cystatin、Stefin[5]。经观察，脑肿瘤中活性的降低是导致肿瘤向恶性发展的始作俑者。

肿瘤术后复发与肿瘤切除多少与肿瘤恶性程度有关，深入研究后发现：切除的肿瘤是诸多瘤体中恶化明显的肿瘤，附近硬膜依然有很多难以用肉眼识别的肿瘤小结节，可能是手术切除不彻底的因素。经检查染色体，原发性瘤体与术后瘤体在染色体表现上一致，肿瘤复发就是手术对病灶切除不彻底所造成[6]。现代分子生物研究的开展，使人们渐渐注意到肿瘤浸润性与肿瘤细胞增殖活性和肿瘤浸润性相关，是造成疾病复发的主要原因。研究中，组织蛋白酶D（cathepsin D）和肿瘤浸润性相关[7]。作为一类酶类物质，其不仅能够将基底膜溶解，而且能够激活机体蛋白B，有效降解胞外基质，使肿瘤能够迅速转移和浸润。虽然行手术切除，但瘤体附近显微镜认为正常的硬膜组织蛋白水平在细胞外基质已发生降解，硬膜受到浸润[8]。进一步研究发现，显微镜下认为正常的病灶与瘤体病理级别有关，随肿瘤恶化程度的加深，cathepsin D的表达要比未复发的水平高。

蛋白酶与抑制剂不同状况表达会显示肿瘤细胞变化与转移，这类蛋白酶一般在溶酶体半胱氨酸蛋白酶中，需关注的是组织蛋白酶B与抑制剂。类型不同的患者血清中蛋白酶的变化展现其在肿瘤预后评价中存在潜在价值[9-10]。机体蛋白酶B为溶解人体半胱氨酸内切蛋白水解物质，作用较广，在人体中参与生理、病理的全部环节，能够促使肿瘤细胞转移与浸润，是诊断疾病的核心要点。组织蛋白酶在人体的多个细胞中广泛分布，有助于蛋白质的多路径降解，胞外蛋白质步入细胞则会对人体内蛋白酶水解，并在细胞消化，维持蛋白质降解与合成的平衡。其不仅能够将蛋白前体激活，还与生理活化与免疫反应抗原加工有关。

本研究得出：CatB于恶性脑膜瘤中具有较高表达水平，且CatB于疾病中的表达也较高。这表示CatB和脑膜瘤的病变程度有关。临床上，两者均可用于区分疾病的良恶性。CatB在良性与非典型性上也具备优良的区分价值。

综上所述，CatB水平明显要比良性者高，有希望在后期对脑膜瘤的良恶性诊断提供重要线索。