LncRNA CCAT1在青少年高血压筛查中的效果及靶向miR-181a促使高血压并发血管疾病的产生

马星星，田朝霞，李红梅，田威威，赵娜，薛晓燕

山西医科大学 汾阳学院，山西 汾阳 032200

0 引言

高血压是目前全球范围内最为常见的心脑血管疾病，多见于中老年人[1]。据统计，全球每年新增高血压患者已经高达6.38%～6.54%[2]，且这一数字随着全球老龄化的发展更是有增无减[3]。目前，高血压的发病机制尚未完全明确，研究表明肥胖、饮食习惯、代谢、遗传等多种情况均可能引发高血压[4]。近年来，随着高血压的发展，青少年患病情况日益严重[5]。且青少年高血压通常伴随隐匿性极高、典型病症少的特点，约超过75%的青少年患者未被诊断出来[6]。高血压的存在，极易引起机体组织中的多数器官、组织的病变坏死，其中以心血管疾病最为常见也最为严重[7]。心力衰竭、冠心病即是高血压极常见的继发疾病，一旦患者没有得到及时的有效治疗，则有极大可能性造成心肌梗塞、梗死的情况，直接威胁患者的生命健康[8]。

虽然血压检测是判断高血压最直观的指标，但对于隐匿性极强的青少年高血压，可能存在无法鉴别的情况[9]。且由于血压检测无法实现一直动态检测，因此对于青少年高血压的早期筛查仍存在诸多局限性。找到一种可靠的血液标志物，仍是青少年高血压早期筛查的关键。近年来，国内外研究学者将目光聚焦在了长链非编码RNA（LncRNA）上，如LncRNA AK094457、TUG1等，均被发现在高血压中存在异常表达[10-11]。我们发现，LncRNA CCAT1是一种在白血病、多项心脑血管疾病中具有重要作用的基因[12-13]，且对于血管炎症反应有着重要调控作用[14]。目前，CCAT1在高血压中的情况尚无研究证实，而我们却发现CCAT1可以通过miR-181a参与口腔癌的发生[15]，而miR-181a是一种已被证实在高血压中具有重要作用的基因[16]。于是我们推测，CCAT1可能同样与高血压的产生有着密切关系。为了证实我们的猜想，以及为未来临床筛查青少年高血压提供新的参考依据，本次研究将对CCAT1在高血压中的作用展开分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取山西医科大学汾阳学院附属三甲医院2019年8月-2021年1月收诊高血压患者56例为观察组。纳入标准：相关检查后确诊为高血压疾病；年龄12～18岁。排除标准：排除既往有严重心血管疾病史患者；排除合并其他心脑血管疾病、自身免疫性缺陷、感染性疾病、肿瘤疾病患者；排除器官衰竭功能不全患者；排除药物过敏患者；排除入院前半年内接收了抗生素类药物、手术、放化疗治疗患者。另选取同时期健康体检者65例为对照组，纳入排除标准：年龄12～18岁；拥有完整病例资料，既往无重大病史；体检结果均正常。抽取两组入院时空腹静脉血液5mL，离心取得血清后进行后续检测。本次实验已获得山西医科大学汾阳学院伦理委员会批准（批准号：2022007），以上所有研究对象均签署了知情同意书。

1.2 qRT-PCR检测

取得待测血清，使用TRIzol（美国Invitrogen）提取总RNA。按照逆转录试剂盒说明书（日本TaKaRa，PrimeScriptTM RT reagent Kit）逆转录为cDNA，以GAPDH与U6为内参（引物序列由美国Invitrogen完成，见表1），进行扩增（日本TaKaRa，TB Green® Fast qPCR Mix）。反应条件：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 1min，共35个循环，2-△△ct计算相对表达量，见表1。

表1 引物序列

1.3 细胞资料

人冠状动脉平滑肌细胞HCASMC、人心肌细胞AC16购买自中国北纳生物科技，使用90%高糖DMEM与10%FBS的培养基，在5%CO2、37℃的环境下进行培养。

1.4 细胞转染

细胞接种于1 2 孔板，当细胞长满孔底80%时，使用Lipofectamine（美国Invitrogen，Lipofectamine®2000）分别将转染过表达CCAT1载体（sh-CCAT1组）、靶向沉默CCAT1载体（si-CCAT1组）、CCAT1空载体（NC-CCAT1组）及miR-181a模拟物序列（miR-mimics组）、miR-181a抑制物序列（miR-inhibitor组）、miR-181a阴性对照（miR-NC）转染至HCASMC、AC16中。

1.5 细胞增殖能力检测

转染后细胞接种于96孔板（0.25×104个/孔），每孔200μL。24h、48h、72h、96h时，加入10μLCCK-8试剂（中国Biosharp），避光孵育2h。酶标仪（美国Invitrogen，Multiskan™ FC 酶标仪）测量各孔吸光度值（450nm）。

1.6 细胞凋亡能力检测

胰酶消化转染后细胞，PBS调整细胞为1×106个/mL，离心10min（500个重力加速度），除去残余液体，加入Binding buffer 500μL重悬。避光环境下加入Annexin V-FITC（美国BD）、PI各5μL，充分振荡混匀，室温下静置30min，流式细胞仪（美国Beckman Coulter，CytoFLEX流式细胞仪）检测细胞凋亡率。

1.7 双荧光素报告酶实验

使用在线靶基因预测网站ENCORI（http://starbase.sysu.edu.cn/）分析CCAT1与miR-181a的序列关系。构建野生型CCAT1（CCAT1-WT）及缺失miR-181a结合区域的突变体CCAT1（CCAT1-MUT）。分别将CCAT1-WT与CCAT1-MUT荧光素报告载体与miR-181a模拟物序列、阴性对照共转染至细胞中，48h后使用双荧光素报告酶试剂盒（上海沪震实业）检测荧光素酶活性。

1.8 拯救实验

将过表达CCAT1载体与miR-181a模拟物序列共转染至细胞中，设为A组；另将单独转染过表达CCAT1载体的细胞设为B组；转染CCAT1空载体的细胞设为C组，比较3组细胞生物学行为变化。

1.9 统计学方法

SPSS 22.0软件进行统计学分析；Graphpad8软件进行图形绘制。所有实验均重复3次，结果以（均数±标准差）的形式记录，组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析及LSD事后组内检验；多个时间点比较采用重复测量方差分析以及bonferroni事后组内检验；预测价值采用ROC曲线分析；当P＜0.050时认为该组数据存在统计学差异。

2 结果

2.1 CCAT1对青少年高血压的筛查效果

观察组血清中CCAT1为（3.18±0.62），高于对照组血清中CCAT1（P＜0.05）；ROC曲线分析显示，当血清中CCAT1＞2.92时，预测高血压发生的灵敏度为66.07%，特异度为78.46%（P＜0.05），见图1。

图1 CCAT1 对青少年高血压的筛查效果

2.2 CCAT1的作用效果

首先，检测CCAT1表达水平发现sh-CCAT1组最高，si-CCAT1组最低（P＜0.05），证实转染成功。生物学行为检测结果显示，在HCASMC中，sh-CCAT1组增殖能力最强，凋亡率最低，si-CCAT1组增殖能力低于NC-CCAT1组，凋亡率高于NC-CCAT1组（P＜0.05）；而在AC16中，sh-CCAT1组增殖能力最低，凋亡率最高，si-CCAT1组增殖能力高于NC-CCAT1组，凋亡率低于NCCCAT1组（P＜0.05），见图2。

图2 CCAT1 的作用效果

2.3 miR-181a的作用效果

同样，检测miR-181a表达水平发现miRmimics组最高，miR-inhibitor组最低（P＜0.05），证实转染成功。生物学行为检测结果显示，在HCASMC中，miR-mimics组增殖能力最低，凋亡率最高，miR-inhibitor组增殖能力高于miR-NC组，凋亡率低于miR-NC组（P＜0.05）；而在AC16中则反之（P＜0.05），见图3。

图3 miR-181a 的作用效果

2.4 CCAT1与miR-181a的关系验证

首先，我们通过ENCORI发现CCAT1与miR-181a存在可结合的互补位点，随后通过双荧光素报告酶实验发现在HCASMC与AC16细胞，CCAT1-WT的荧光活性均受到miR-181a模拟物的抑制（P＜0.05）。而检测转染了过表达CCAT1载体、靶向沉默CCAT1载体及CCAT1空载体后的HCASMC、AC16中miR-181a表达情况可知，sh-CCAT1组均最低，而si-CCAT1组高于NC-CCAT1组（P＜0.05），见图4。

图4 CCAT1 与miR-181a 的关系验证

2.5 拯救实验

A组与C组增殖、凋亡能力均无差异（P＞0.05），HCASMC中B组增殖能力高于其他两组，而凋亡率低于其他两组（P＜0.05）；AC16中B组增殖能力低于其他两组，而凋亡率高于其他两组（P＜0.05），见图5。

图5 拯救实验

3 讨论

高血压作为全球发病率最高的血管疾病，其潜在威胁必须引起临床的重视[17-18]。对于青少年高血压而言，可能由于患者的机体功能处在较好的阶段，很长一段时间内不会表现出病理改变。而心脑血管长期处在高血压的状态下，一旦发病可能将造成比中老年高血压患者更为严重的后果[19]。因此，对于青少年高血压的早期筛查是重中之重。而本次研究通过探究CCAT1对青少年高血压的筛查效果以及对并发疾病的初步机制探究，可以为将CCAT1作为青少年高血压血液标志物的后续研究提供坚实的基础。

本次研究首先对青少年高血压患者与健康体检者外周血中CCAT1进行了检测，发现CCAT1在高血压中呈高表达，提示CCAT1可能参与了高血压的发生、发展。而这也与既往研究中对CCAT1的相关研究的情况一致[20-24]。随后，通过ROC曲线分析，本研究发现CCAT1对于预测高血液的发生的灵敏度为66.07%，特异度为78.46%，这也提示CCAT1具有成为未来高血压血液标志物的潜力。目前，高血压的诊断仍主要依靠血压检测仪，无法实现大范围的临床筛查。而血液标志物的出现，不仅可以有效弥补这一缺陷，还更加方便、快捷、迅速，降低人工成本，具有更高的经济效应。但是，对于ROC曲线的分析结果，需要大量的临床数据才可以获取最佳的cut-off截值，而本次研究中仅纳入了总共121例对象，不排除结果可能存在一定误差。

综上所述，CCAT1在青少年高血压中呈高表达，具有成为青少年高血压血液标志物的潜力；CCAT1可通过靶向miR-181a促进HCASMC活化与AC16的凋亡引起冠心病、心力衰竭等疾病的发生。但是，本次研究仍存在不足之处有待改进。如我们本次研究中仅针对HCASMC与AC16展开了分析，对于CCAT1与其他高血压并发疾病的关系还不清楚；且对于CCAT1的作用机制，还值得我们进行更深入的实验以确认。此外，我们还需要扩大研究样本，进行大数据的分析，进一步体现出CCAT1对青少年高血压的筛查效果。