基于尿素酶的幽门螺杆菌唾液检测分析

李若彬，王柯为，李梦娜，杨贺迪，冷锋

哈尔滨医科大学大庆校区，黑龙江 大庆 163000

0 引言

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类，能够导致Hp病包括由Hp感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等，存在于大多数慢性胃炎患者的胃黏膜上皮表面或腺体的黏液层中[1-2]。在发达国家，大约占比30%～60%，在发展中国家，大约占比60%。Hp能产生大量的脲酶，其活性是其他变形杆菌的20～70倍，是所有已知产生脲酶的细菌中最活跃的。Hp产生脲酶，该酶催化游离氨的产生[3]。氨气在Hp周围形成“氨气云”，中和胃酸，保护Hp免受胃黏膜酸性环境的影响。医学从业人员认为体内的Hp通常可以消除，应进行全国普查。至少那些曾经做过胃部手术、胃部疾病或者胃癌的患者应该接受Hp检测，感染者应接受杀菌治疗，希望能够控制胃癌。

1 检测材料

Hp唾液检测试剂：尿素50g，酵母浸膏0.1g，酚红0.01g，乙醇，PH计。

呼气试验：13C呼气试验分析仪（WLD600），13C胶囊。

2 实验检测

2.1 Hp唾液检测方法

2.1.1 采样预处理

患者一周之内不可服用抗生素，铋剂，质子泵抑制剂等药物，留取唾液样本前一晚十二点之后禁食禁水（见图1）。清晨刷牙前留取唾液样本至采集管1，通过调节唾液PH酸碱度至6.8降低唾液链球菌酶活性，减少其对实验结果的影响。

图1 实验检测步骤

2.1.2 口腔Hp半定量检测

将采样预处理后的样本用胶头滴管吸入3～5滴，放入配置好的反应盒内，5min后观察其颜色改变，通过比色法进行酶动力学实验，以此实现对Hp的半定量[4]。5min后反应试剂盒内溶液为黄色则为阴性，变为红色则显示阳性，且随着HP含量的增加，溶液的颜色也会随之加深，由浅红色变为深红色或玫红色[5-6]。

2.2 13C呼气试验

呼气试验是检测Hp感染的首选方法，主要是13C和14C尿素呼气试验，具体如下：

（1）呼气试验检测Hp主要是通过13C和14C的尿素呼气试验，由于尿素能够在尿素酶的作用下生成氨和CO2，在患者进行呼气试验的时候可以先服用一颗有标记的13C或14C尿素，当患者体内有Hp时，它就可以被分解为氨和CO2，在使用同位素标记的CO2将会通过呼吸道排放到体外，因此可以用患者呼气来检测Hp感染的情况，同位素标记的CO2越多则Hp感染的情况越严重[7-8]。

（2）呼气试验无创无痛，减轻了患者的疼痛感，并且敏感性高，检测的准确性率高，不会造成交叉感染，所以Hp的检测首选呼气试验的方法13C呼吸试验检测的方法，通过检测被13C标记的CO2是否超过100dpm来确定是否有Hp感染，本文主要运用的是13C[9-10]。

3 实验分析

3.1 尿素浓度与反应时间确定

尿素酶催化尿素水解，生成两分子的氨和一分子的CO2，同时也引起溶液PH的变化（见图2），因此，分别将浓度为0.1、0.7、7、30、50、70、140g/L的10mL尿素溶液与1mL，0.5U/mL的尿素酶溶液混合，30min后检测其PH酸碱度，结果显示，尿素浓度在0.7、7、30、50、70g/L时，PH变化最为明显，且5组数据之间无显著差异。据此，本实验试剂尿素溶液浓度设置为50g/L。

图2 不同浓度尿素溶液检测结果

将10mL的尿素溶液与0.5U/mL的尿素酶溶液充分混合，静置5min，30min，60min，90min，分别检测其PH变化，经过多次实验发现，在反应时间为5min时其PH酸碱度与反应时间30min的PH酸碱度无显著差异。据此本检测方式设定反应时间为5min。

3.2 唾液链球菌的分析

口腔中的唾液链球菌是最为主要的产生尿素酶分解尿素的细菌，因此会对实验结果产生一定影响。根据唾液链球菌的酶活性数据与PH数据，结合matlab软件进行数据拟合，软件拟合得出的R-square=0.9613，可以看出拟合的精确度较高，同时也符合实际情况，详见表1。

表1 唾液链球菌酶活性与PH关系变化图表

3.3 评价指标

本文对200组检测结果进行综合分析，对检测结果的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确率、一致性进行统计分析，具体方法如下：

计算灵敏度数学方法：灵敏度的计算需要与阳性标本数与总阳性标本数有关，计算公式如下：

计算特异性数学方法：特异性的计算主要与阴性标本数与总的阴性标本数有关，计算公式如下：

计算特异性数学方法：阳性预测值主要与真阳性标本数和诊断实验结果呈阳性标本数有关,计算公式如下：

计算阴性预测值数学方法：阴性预测值主要与真阴性标本数和诊断实验结果呈阴性标本数有关,计算公式如下：

计算准确性数学方法：准确性主要与真阳性标本数、真阴性标本数以及总标本数有关,计算公式如下：

计算一致性数学方法：计算一致性主要与共阳性标本数和阳性总数有关，计算公式如下：

4 实验结果

在200例受试者中，Hp唾液检测试剂盒检测出受试者阳性的数目为122例，Hp唾液检测试剂盒检测出受试者阴性的数目为78例；Hp唾液检测试剂盒检测出受试者13C阳性的数目为117例，Hp唾液检测试剂盒检测出受试者阴性的数83例，122例Hp唾液检测试剂盒阳性标本对应13C阳性117例，Hp唾液检测试剂盒阳性标本对应假阳性7例；78例Hp唾液检测试剂盒阴性标本对应13C阴性83例，Hp唾液检测试剂盒阴性标本对应假阴性2例；本实验所采用的试剂盒灵敏性通过前面数学方法计算达到了98.29%，特异性通过前面数学方法计算达到了90.36%，阳性预测值通过前面数学方法计算达到了94.26%，阴性预测值通过前面数学方法计算达到了96.15%，准确性通过前面数学方法计算达到了95%，差异性通过前面数学方法计算达到了5%，低于实验允许变异系数（10%），所以本实验具有很高可行性与可信度[11-14]。

5 讨论

Hp经口到达胃黏膜后定居感染，会引发慢性、浅表性胃炎、溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、慢性萎缩性胃炎、肠化生、胃癌等，大量研究数据表明口腔中存在Hp，且具有较高的检出率[15-16]。

Hp产生尿素酶，可分解尿素生成CO2和氨气。13C呼气试验通过标记、检测Hp尿素酶分解生成的CO2，实现对Hp的检测；Hp唾液检测试剂盒，通过检测被氨气碱化的溶液，确定是否有Hp感染[17-18]。Hp唾液检测试剂盒与13C呼气试验检测结果存在一定差异，但是差异性为5%，低于实验允许变异系数10%，无统计学意义。Hp唾液检测试剂盒实验标本为唾液[19]，对人体无危害，且检测时间短，操作简单，可重复检测，适用于家庭、学校的初查。

6 防治建议

想要彻底的把Hp消灭并不是一件困难的事，大约85%的细菌感染者经过7～14d的正确治疗过后，位于身体内部的Hp几乎能够被彻底消除[20-21]。我们提出如下建议，应该有一定周期性的开展全民普查，对接受过胃部手术、有过胃病、或亲属中有过胃癌的人进行Hp的定时检查，同时在感染者进行合理的杀菌治疗，这样有利于防控胃癌的发生，减少全国胃癌发病率[22-23]。