补喂胍基乙酸对运动训练伊犁马血浆胍基乙酸、肌酸浓度的影响

刘 律，李晓斌，马 艳，杨 昊，张文杰，鲁 豪，卫鑫岚，高俊杰，欧阳文，杨开伦

（1.新疆农业大学动物科学学院/新疆肉乳用草食动物营养重点实验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆伊犁哈萨克自治州昭苏县种马场，新疆伊犁 835699）

0 引言

【研究意义】肌酸（Creatine，Cr）在动物机体的生命代谢以及能量供应上有极其重要的作用，既可作为营养物质，参与肌肉细胞的合成代谢，又可作为能源物质，为肌肉收缩储备能量[1]。肌酸通常来源于高蛋白的动物性饲粮（鱼粉或肉粉），而草食动物的饲粮中不含肌酸[2]，对肌酸的外源摄取较少。直接在饲粮中添加肌酸[3]或灌喂肌酸水合物[4]，对机体血浆中肌酸、肌酐的浓度无显著影响。、动物机体肌酸的内源合成受到其前体物质胍基乙酸的调控，胍基乙酸（Guanidineacetic acid，GAA）是一种天然存在于脊椎动物体内的氨基酸衍生物[5-6]，从人和狗的尿液中分离得到是肌酸合成的直接前体物[7-8]。【前人研究进展】Ostojic等[9]研究发现，单次口服2.4 g的胍基乙酸1 h后，可增加人血清、尿液中的胍基乙酸和肌酸浓度。饲粮中添加0.06%的胍基乙酸，饲喂60 d后可以影响育肥猪的糖酵解[10]。【本研究切入点】由于机体在运动过程中对能量物质的需求较大，胍基乙酸可转化为肌酸，为机体提供能量。【拟解决的关键问题】选用运动训练伊犁马为研究对象，于饲粮中添加不同水平的胍基乙酸，研究补喂胍基乙酸对运动训练伊犁马血浆胍基乙酸、肌酸浓度的影响，为伊犁马的科学养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2020年5月17日～6月21日在新疆伊犁哈萨克自治州昭苏种马场进行。

挑选20匹年龄为2～3岁、体重[（373.2±30.53）kg]相近且经过严格训练的速度赛用伊犁马。随机分为4组，每组5匹（3♀+2♂），进行为期5周的试验。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

所有试验马匹所喂试验饲粮组成及营养水平一致。每匹马每天饲喂精料补充料4 kg，自由采食青干草，各组每天每匹马分别补喂0（CON组）、25（25 GAA组）、50（50 GAA组）、75 mg/kg BW（75 GAA组）的胍基乙酸（购自北京君德同创农牧科技股份有限公司，纯度≥98.0%）。胍基乙酸与玉米和次粉按照2∶1∶1制作成颗粒后与精料补充料混合补喂。试验中胍基乙酸的补喂量参考Ostojic等[9]和Setoue等[11]的研究结果。表1

表1 试验精料补充料和青干草营养水平（干物质基础，%）Table 1 Nutrient levels of concentrate supplementation and green hay（DM basis，%）

1.2.2 饲养管理

试验马匹单厩饲养管理，自由饮水。每天每匹马饲喂4 kg精料补充料，自由采食青干草。补喂的胍基乙酸与精料补充料分为2份装入封口袋，每日分2次饲喂，分别在08：00和20：00；青干草每日分3次添喂，分别在07：30、13：30和19：30。饲喂时先粗后精，先采食粗饲料1 kg，再补给精料补充料，待精料补充料采食完毕后，继续添喂粗饲料。每天按时打扫马厩，清除粪便和垫料，更换垫草。

1.2.3 训练方案及场地

试验马匹每天1次速度训练，马匹训练时间安排在11：00～13：00或者17：30～19：30。首先热身训练，骑手骑乘试验马在草道上慢步10 min，随即进入沙道，进行10 min快步训练，15 min慢跳训练，停止训练，牵遛5～10 min，直至马匹呼吸平稳。训练场地为新疆昭苏种马场伊犁马测试调训中心，赛道由椭圆形沙道和草道组成。内部沙道由细沙构成，深度40 cm，底部为土基，道宽21 m，周长为800 m；外部草道由天然的牧草形成，宽20 m，周长为1 000 m。

1.2.4 样品采集及指标测定

1.2.4.1 血浆生化

于试验第1、3、5、7和10 d的饲喂后2 h使用5 mL肝素钠抗凝管于马匹颈静脉采集血液1管，以3 500 r/min离心10 min，收集上清血浆，分装，-20℃冷冻保存。

于试验第36 d饲喂前0 h及饲喂后1、2、3、4、6、9、12 h使用5 mL肝素钠抗凝管和4 mL氟化钠抗凝管于马匹颈静脉采集血液各1管，以3500 r/min离心10 min，收集上清血浆，分装，-20℃冷冻保存。

（2）无过热现象，轴系相关部件温度不能太高。尾轴管密封装置的工作温度不应超过65℃，中间轴承的工作温度不应超过80℃；

血浆中胍基乙酸、肌酸和肌酐等代谢物指标使用高效液相色谱仪定量分析检测[12]。

1.2.4.2 尿液生化

于试验第36 d，使用自制收尿装置，收集试验马匹24 h尿样，将尿液充分摇匀后，收集样品50 mL存入冻存管，-20℃冷冻保存。

血浆中胍基乙酸、肌酸和肌酐等代谢物指标使用高效液相色谱仪进行定量分析检测[12]。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2010进行初步整理，试验马匹血浆和尿液肌酸代谢物指标采用SPSS 19.0统计软件的ANOVA程序进行单因素方差分析，差异显著则用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”（mean±SD）表示，以0.05≤P＜0.10作为有显著趋势，P＜0.05为差异显著水平，P＜0.01为差异极显著水平。

2 结果与分析

2.1 补喂GAA对伊犁马饲喂后2 h血浆肌酸代谢物浓度的影响

2.1.1 补喂胍基乙酸对伊犁马饲喂后2 h血浆Cr/GAA的影响

研究表明，25 GAA组马匹在试验第5、7及10 d的饲喂后2 h血浆Cr/GAA极显著高于CON组（P＜0.01）；50 GAA组马匹在试验第1、3、5、7及10 d的饲喂后2 h血浆Cr/GAA均极显著高于CON组、25 GAA组、75 GAA组（P＜0.01）；75 GAA组马匹在试验第1、7 d的饲喂后2 h血浆Cr/GAA极显著高于CON组（P＜0.01）。表2

表2 补喂胍基乙酸下伊犁马饲喂后2 h血浆Cr/GAA变化Table 2 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma Cr/GAA at 2 h after feeding in Yili horses（%）

2.1.2 补喂胍基乙酸对伊犁马饲喂后2 h血浆肌酐浓度的影响

表3 补喂胍基乙酸下伊犁马饲喂后2 h血浆肌酐浓度变化Table 3 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma creatinine concentration at 2 h after feeding in Yili horses（µmol/L）

2.2 补喂胍基乙酸对伊犁马血浆肌酸代谢物浓度的影响

2.2.1 补喂胍基乙酸对伊犁马血浆胍基乙酸浓度的影响

研究表明，与CON组相比，25 GAA组马匹在饲喂后6 h血浆胍基乙酸浓度显著低于CON组（P＜0.05）；50 GAA组马匹在饲喂后3 h、4 h和6 h血浆胍基乙酸浓度显著低于CON组（P＜0.05），且在饲喂后6 h达到极显著水平（P＜0.01）；75 GAA组马匹在饲喂后1、3、4、6、9和12 h血浆胍基乙酸浓度显著低于CON组（P＜0.05），且在饲喂后1、4、6 h达到了极显著水平（P＜0.01）。25 GAA组马匹在饲喂后1、3、4、6、9和12 h血浆胍基乙酸浓度显著低于CON组（P＜0.05）。50 GAA组马匹在饲喂后2、9 h血浆胍基乙酸浓度极显著高于75 GAA组（P＜0.01），饲喂后2、12 h显著高于25 GAA组（P＜0.05）。表4

表4 补喂胍基乙酸下伊犁马血浆胍基乙酸浓度变化Table 4 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma guanidine acetic acid concentration in Yili horse（µmol/L）

2.2.2 补喂胍基乙酸对伊犁马血浆肌酸浓度的影响

研究表明，与CON组相比，25 GAA组马匹饲喂后9 h血浆肌酸浓度显著高于CON组（P＜0.05）；50 GAA组马匹饲喂后1、2、3、9和12 h血浆肌酸浓度极显著高于CON组（P＜0.01）；75 GAA组马匹饲喂后1、2、3和9 h血浆肌酸浓度极显著高于CON组（P＜0.01）。50 GAA组马匹饲喂后1、2、3、6和9 h血浆肌酸浓度极显著高于25 GAA组（P＜0.01）。表5

表5 补喂胍基乙酸下伊犁马血浆肌酸浓度变化Table 5 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma creatine concentration in Yili horse（µmol/L）

2.2.3 补喂胍基乙酸对伊犁马血浆Cr/GAA的影响

研究表明，与CON组相比，25 GAA组马匹在饲喂前及饲喂后2、3、4、9和12 h血浆Cr/GAA均极显著高于CON组（P＜0.01）；50 GAA组马匹在饲喂前及饲喂后1～12 h血浆Cr/GAA均极显著高于CON组（P＜0.01）；70 GAA组马匹在饲喂前及饲喂后1～9 h血浆Cr/GAA均极显著高于CON组（P＜0.01）。表6

表6 补喂胍基乙酸下伊犁马血浆Cr/GAA变化Table 6 Effect of guanidine acetic acid supplementation on plasma Cr/GAA in Yili horse

2.2.4 补喂胍基乙酸对伊犁马血浆肌酐浓度的影响

研究表明，与CON组相比，各试验组马匹饲喂后0、1、2、3、4、6、9和12 h的血浆肌酐浓度均无显著影响（P＞0.05）。表7

表7 补喂胍基乙酸下伊犁马血浆肌酐浓度变化Table 7 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma creatinine concentration in Yili horse（µmol/L）

2.3 补喂胍基乙酸对伊犁马24 h尿液肌酸代谢物排出量的影响

研究表明，各试验组肌酸代谢物排出量均高于CON组。与CON组相比，50 GAA组和75 GAA组的24 h尿液胍基乙酸、肌酸、肌酐排出量均极显著高于CON组（P＜0.01），25 GAA组的24 h尿液肌酸、肌酐排出量均极显著高于CON组（P＜0.01）。表8

表8 补喂胍基乙酸下伊犁马24 h尿液肌酸代谢物排出量变化Table 8 Effect of guanidine acetic acid supplementation on 24 h urinary creatine metabolite excretion in Yili horse

3 讨论

3.1 补喂GAA对伊犁马饲喂后2 h血浆肌酸代谢物浓度的影响

GAA是人和动物体内合成肌酸的主要内源性物质，肌酸作为体内新陈代谢的重要分子，是能量暂时储存的场所。肌酸在体内有游离态肌酸和磷酸肌酸两种形式，二者一起构成了磷酸原系统[13]。当机体ATP过剩时，磷酸肌酸可将能量储存，当机体ATP不足时，磷酸肌酸将ATP释放，但因为ATP不能穿透细胞膜，故其不可直接由体外补充得到，补充的能量物质只能是葡萄糖或其他能源物质。GAA作为肌酸的天然前体物质，可通过在日粮中添加GAA来补充肌酸。肌酸在肌酸激酶的催化下生成磷酸肌酸，磷酸肌酸是动物体所有活细胞能源利用的关键物质[14]，对动物的能量代谢和生长发育起着非常重要的作用[15-17]。

试验中，补喂GAA显著提高了各试验组伊犁马血浆Cr/GAA，其中50 GAA组极显著高于CON组、25 GAA组、75 GAA组，显著提高了50 GAA组马匹肌酐浓度，对25、75 GAA组马匹肌酐浓度无显著影响。Ostojic等[9]研究发现，单次口服2.4 g GAA后，可极显著增加人血清GAA、肌酸的浓度，对肌酐的浓度无显著影响。Majdeddin等[18]选用1日龄罗斯308公鸡720只，随机分成3个处理组，分别在第26 d和第39 d采血，0.6、1.2 g/kg的GAA均提高了育肥鸡生长阶段的饲料转化率，在试验第26 d，0.6、1.2 g/kg GAA添加量组均可增加育肥鸡血液中精氨酸含量，分别提高了18.3%、30.8%，同时均增加了两个GAA处理组育肥鸡的胸肌中磷酸肌酸、肌酸的含量。He等[19]试验一将180头平均体重为（33.61±3.91）kg的公猪按体重和性别分成5个处理组。试验表明，98 d时，血清GAA和肝脏肌酐含量随日粮中GAA添加水平的增加呈线性上升趋势，但对于第35、70、98 d血清肌酐含量无显著影响。与试验研究结果一致。外源的GAA可转化为肌酸，易于生物的利用，且添加GAA可节约精氨酸，使精氨酸更多的用于其他生理代谢。

3.2 补喂GAA对伊犁马血浆和尿液肌酸代谢物含量的影响

GAA由甘氨酸和L-精氨酸合成，通过血液循环被转运至肝脏，经载体蛋白转运进入肝脏细胞合成肌酸，释放进入血液循环，然后经肌酸转运蛋白（CreaT）将肌酸转运进入肌纤维和其它组织中[20]。肌酸通过肌酸转运蛋白进入骨骼肌细胞后，在肌肉组织中被磷酸化形成磷酸肌酸[21]，参与机体反应后，代谢为肌酐，经尿液排出体外[13]。

试验中，CON组血浆GAA、肌酸分别在饲喂后4、6 h达到峰值，而各试验组均在饲喂后2 h出现峰值。各试验组马匹在饲喂前及饲喂后血浆Cr/GAA均极显著高于CON组。血浆肌酐方面，各试验组肌酐变化波动不大，但浓度普遍都高于CON组。对于肌酸代谢物排出量，各试验组均极显著高于CON组。He等[19]研究发现，在育肥猪饲粮中添加300～1 200 mg/kg的GAA，均可增加第98天肝脏肌酸和血清GAA的浓度，但对于血清肌酐含量无显著影响。Li等[22]选用48头安格斯公牛，随机分为4组，分别添加0、0.3、0.6和0.9 g/kg DM的GAA，补喂104 d后，0.6、0.9 g/kg组的血液肌酸含量高于对照组，而L-精氨酸甘氨酰转移酶活性低于对照组。与试验研究结果一致。GAA的外源补喂，促进了伊犁马机体对GAA的快速吸收。

试验中，50 GAA组马匹血浆肌酸、肌酐浓度及尿液肌酸、肌酐排出量最高，且高于75 GAA组。Tachikawa等[23]在非洲爪蟾卵母细胞中导入含有大鼠GAA转运载体γ-氨基丁酸转运体2的基因，体外培养一段时间后发现细胞对胞外GAA的吸收呈现饱和效应，当转运载体达到饱和，其GAA的转运速率不再增加，随着外源GAA浓度的持续增加，过量的GAA则会对载体转运产生一定程度的自身抑制。与试验研究结果一致。75 GAA组补喂水平从肠道吸收后进入肝脏细胞，达到了马匹肝细胞GAA转运载体的饱和浓度，且过量的GAA对肝细胞转运GAA分子产生一定程度的抑制。

4 结论

补喂胍基乙酸极显著提高了50 GAA组马匹第1～10 d以及75 GAA组马匹7 d、10 d的饲喂后2 h血浆Cr/GAA（P＜0.01），补喂胍基乙酸极显著提高了各试验组血浆Cr/GAA（P＜0.01），极显著提高了50、75 GAA组马匹血浆肌酸浓度及24 h尿液肌酸代谢物排出量（P＜0.01）。补喂胍基乙酸提高了伊犁马血浆肌酸代谢物浓度，促进了伊犁马机体对胍基乙酸的快速吸收，以供机体利用，适宜添加水平为50 mg/kg BW。