P16、Ki-67免疫组化染色对ClN分级诊断的影响及其与宫颈HPV感染的相关性分析

王青飞,徐琴琴（江西省乐平市中医医院,江西 乐平 333300）

宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤，随着病情发展会导致女性输尿管梗阻、尿毒症、恶病质等，累及患者全身器官，具有较高的死亡率[1]。目前，临床治疗该病主要根据病情分级制定针对性治疗方案，因此，诊断宫颈癌级别成为其中最关键步骤之一。宫颈癌主要是由于宫颈感染HPV病毒所致，但该病毒发展时间缓慢，从感染到致癌需要≥10年时间，因此及早诊断是治疗及预防宫颈癌的关键[2]。目前，临床诊断宫颈癌以宫颈管活组织检查为主，但相关研究表明，P16、Ki-67免疫组化染色能客观给出细胞增殖提示，并与宫颈HPV感染存在联系，对诊断宫颈癌具有重要意义。基于此，本研究主要分析P16、Ki-67免疫组化染色对CIN分级诊断的影响及其与宫颈HPV感染的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2017年3月-2018年3月我院妇科门诊TCT诊断异常的患者中选取60例作为研究对象，患者均知情本次研究并同意参加。HE诊断结果显示，慢性宫颈炎19例、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ级15例、Ⅱ级12例、Ⅲ级10例、宫颈癌4例，根据诊断结果将其分组为慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组及宫颈癌组。

1.2 方法 ①对60例患者宫颈脱落细胞使用TCT相应技术收集，从中提取DNA并检测其聚合酶链反应提升、核酸分子快速导流杂交、脱落细胞HPV分型，使用HPV分型检测试剂盒（凯普生物化学有限公司，批准文号：国药准字S20060011）检测；②获取患者宫颈病理组织，将其石蜡化，脱蜡后置入乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160518），将其放入微波炉中进行热修复，定时为12min；为其滴加过氧化氢（南昌白云药业有限公司，批准文号：国药准字H36021594）500ml:15g（3%），剂量100μL，并定时10min孵育；滴加剂量100μL一抗（兰州生物制品研究所，国药准字S20023015），P16、Ki-67稀释度分别为1∶100、1∶50，定时90min孵育；滴加剂量100μL二抗（兰州生物制品研究所，国药准字S20023015），定时20min孵育；滴加DAB染色液，并使用显微镜对其显色进行观察；阳性对照以磷酸盐缓冲液（PBS）替代一抗进行观察，阳性对照以P16、Ki-67表达观察为主。

1.3 观察指标 ①诊断宫颈癌阴性、阳性。采用TBS宫颈细胞学诊断标准，结果显示正常或炎症表示为阴性，宫颈TCT的检查结果无明确意义、非典型鳞状细胞和以上级别病变则表示为阳性。②诊断HPV分型。包括低危型、中危型、高危型三大类，其中，高危型有HPV-16、HPV-18、HPV-35、HPV-39、HPV-51等13种亚型。③CIN分级诊断。对病理组织切片，医师阅片并作出分级判断，若胞核、胞浆中均有P16表达，且胞核有Ki-67表达，则表示为阳性；采用半定量评分对P16、Ki-67表达强度及分布进行级别判断，（-）指代P16、Ki-67均不表达，有胞浆染色或局灶表达阳性、基底或基底旁表达，（+）指代染色位于基底、基底旁细胞，（++）指代染色位于基底下1/3内细胞，（+++）指代染色位于＞基底下1/3而＜2/3内细胞，（++++）指代染色位于＞基底下2/3的全层细胞。

诊断准确率=符合例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法 使用SPSS20.0分析数据，计量资料以（±s）表示、计数资料以（n,%）表示，分别以t、χ2检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 P16、Ki-67免疫组化结合半定量评分与HE染色CIN分级的诊断结果比较 使用P16、Ki-67免疫组化结合半定量评分对患者病情进行诊断，且结果与HE染色CIN分级的诊断结果相比：慢性宫颈炎组患者两项诊断结果相同，诊断结果完全相符，CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组诊断结果相符率为94.59%，两组差异显著（P＜0.05）。具体见表1、表2。

表1 P16、Ki-67免疫组化结合半定量评分

表2 P16、Ki-67免疫组化结合半定量评分与HE染色诊断结果相同情况

2.2 HPV感染与P16之间的关系 结果显示，P16显示阳性与HPV感染呈正比，即其显示阳性程度越高，HPV感染几率越高，差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）；以HPV-16、HPV-18、HPV-35、HPV-39、HPV-51为例，观察其阳性与阴性，差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）。具体见表3。

表3 HPV感染与P16之间的关系

3 讨论

宫颈癌是较为高发的恶性肿瘤之一，严重影响女性身体健康，危及患者生命，但若在早期确诊，能有效提升预防与治疗效果。目前，临床诊断主要以疾病组织活检为主，为宫颈癌确诊提供有力证明[3-4]。宫颈上皮内瘤变（CIN）与宫颈癌确诊密切相关；因此，通过对CIN分级能进一步提高诊断准确性，有效提升早期诊断成功率，且有利于疾病治愈，提高预防效果[5]。有研究表明，从宫颈癌患者活检结果中可知，其宫颈脱落细胞中所包含的P16、Ki-67的表达程度与宫颈癌发展存在很大关系，因此，P16、Ki-67对判断CIN分级及诊断宫颈癌具有重要意义[6]。

P16作为一种抑制蛋白，具有广泛的生物应用效果，对癌基因具有相应抑制作用。因此，在患者宫颈脱落细胞中的P16能有效反映CIN分级，同时，检测P16能明确HPV感染程度，对于临床确诊宫颈癌具有重要指导作用[7-8]。Ki-67是一种存在于全身细胞中对癌症具有较高敏感性的表达因子，能有效提示肿瘤细胞的增殖活性[9-10]。相关研究表明，Ki-67在CIN分级的不同分级情况下表达具有较高差异性，因此，Ki-67具有反映肿瘤发展情况的功能，对于临床诊断具有相应指导意义。本研究结果表明P16、Ki-67与CIN分级成正相关，即CIN分级越高，P16、Ki-67表达越强烈，且通过P16、Ki-67免疫组化染色检测宫颈癌，其结果与HE染色诊断慢性宫颈炎的结果相符，与CIN分级患者诊断符合率为94.59%，说明P16、Ki-67免疫组化染色对CIN分级诊断具有积极影响作用。HPV包括高危、中高危型、低危型3种类型，高危型HPV分型是宫颈癌的显著因素之一[11-14]。本研究结果显示，HPV分型越高，P16表达越强烈，说明宫颈癌HPV分型存在相关性。

综上所述，CIN分级与P16、Ki-67表达成正相关，通过P16、Ki-67表达诊断宫颈癌具有显著的临床治疗指导意义，且P16与患者HPV具有相关性，能判断患者转归、预后效果。