木兰花碱通过ROS/KRAS/AMPK抑制结直肠癌sw480细胞干性特征和糖酵解①

刘璨 刘艾鑫 姜昌镐

（延边大学附属医院，延吉 133000）

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，在我国其发病率和病死率分别排第3位和第5位，且呈逐年上升趋势［1］。尽管目前针对结直肠癌临床已有较为系统的治疗方案，如放疗、化疗等，但耐药性及较强的副作用严重降低患者的生存率和生存质量。木兰花碱（magnoflorine，Mag）属于阿朴啡类生物碱，广泛存在于防己科等药用植物中，具有抗氧化、降血糖等药理作用［2］。此外，研究表明Mag能够抑制胃癌进展并通过AKT/mTOR和p38信号通路提高乳腺癌细胞对阿霉素的药物敏感性［3-4］。然而Mag对结直肠癌细胞的影响尚未见报道。本研究以不同浓度Mag处理人结直肠癌sw480细胞，观察Mag对结直肠细胞干性及糖酵解的影响并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料人结直肠癌细胞株sw480购自中国科学院细胞库；Mag购自上海源叶生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、活性氧检测试剂盒购自索莱宝；活性氧诱导剂购自贝博生物有限公司；葡萄糖和乳酸试剂盒购自Sigma；CD133（64326）、p-AMPK（2537）、AMPK（5831）、KRAS（53270）和GAPDH（5174）抗体购自Cell Signaling Technology。电泳仪及电泳槽（E-C Apparatus Corporation，美国）；全波长酶标仪、Western blot转膜仪、Cytation5荧光成像系统和Gel Doc凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）；流式细胞仪（Beckman Coulter，美国）。

1.2 方法

1.2.1 CCK8增殖实验取对数生长期的sw480细胞以2×104个/孔接种于96孔板，待细胞生长至70%左右后，按照实验分组加入不同浓度的Mag（0、10、20、40 μmol/L），分别于24 h、48 h和72 h加入CCK-8试剂（10 μl/孔），2 h后测定450 nm处的吸光度（OD）值。以时间点为横坐标，OD值为纵坐标，绘制各组细胞OD值变化，并进行统计学分析。

1.2.2 球体形成实验sw480细胞经不同浓度Mag处理48 h后，以3 000个/孔接种于低黏附6孔板中。DMEM/F12培养液（含20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF和10 μl/ml B27）培养2周，分别于第1、7、14天拍照，并计数克隆形成数量。

1.2.3 球体免疫荧光实验收集成球细胞，经4%多聚甲醛固定、0.2% Triton X-100通透以及3%BSA封闭后，加入CD133抗体（1∶200）孵育2 h，PBS清洗后，加入FITC标记的荧光二抗。含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片后，Cytation5荧光成像系统进行拍照。

1.2.4 糖酵解检测实验sw480细胞经不同浓度Mag处理24 h后，分别提取蛋白，根据试剂盒说明书分别检测细胞葡萄糖消耗和乳酸生成。

1.2.5 流式细胞术sw480细胞接种于6孔板，经不同浓度Mag处理后，每孔加入10 μmol/L DCFH-DA 1 ml，37℃孵育30 min后，PBS清洗3次，流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

1.2.6 Western blot实验收集细胞碎片进行裂解，每孔30 μg蛋白经10%SDS-PAGE电泳（120 V、90 min）根据分子量分离蛋白样品，然后在300 mA、60 min条件下，将蛋白从凝胶转移至PVDF膜。经5%脱脂奶粉TBST缓冲液室温封闭2 h后，分别加入抗体p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、KRAS（1∶2 000）和GAPDH（1∶3 000）室温孵育2 h，TBST清洗3次后，加入HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶8 000）室温孵育2 h，凝胶成像系统进行拍照。

1.3 统计学分析计量数据以±s表示，用Graphpad Prism 8.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Mag对sw480细胞活性的影响以不同浓度梯度的Mag处理sw480细胞，并通过CCK-8检测不同时间点细胞活性变化结果如表1所示，与对照组（Mag 0 μmol/L）相比，Mag给药组（10、20、40 μmol/L）细胞活性在24 h、48 h和72 h均明显降低。

表1 各组细胞OD480 nm值比较（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell OD480 nm in each group（±s，n=3）

表1 各组细胞OD480 nm值比较（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell OD480 nm in each group（±s，n=3）

Note：Compared with Mag control（0 μmol/L）group，1）P<0.01，2）P<0.001.

Groups Mag 0 μmol/L Mag 10 μmol/L Mag 20 μmol/L Mag 40 μmol/L 24 h 0.93±0.049 0.69±0.0501）0.61±0.0302）0.52±0.0302）48 h 1.33±0.08 0.85±0.041）0.75±0.031）0.63±0.022）72 h 1.95±0.05 1.13±0.052）0.89±0.042）0.77±0.052）

2.2 Mag对sw480细胞球体形成大小和数量的影响Mag处理后，球体形成实验结果显示，第7天各组细胞球体形成数量分别为193.67±8.74、129.67±12.22、95.67±13.32、54.67±7.37。第14天球体形成 数 量 分 别 为406.67±20.40、226.33±25.15、14.33±17.62、83.00±10.15。与对照组相比，Mag给药组球体形成大小和数量均降低，表明Mag能够抑制sw480细胞球体形成能力。见图1。

图1 Mag对sw480细胞球体形成大小和数量的影响Fig.1 Effect of Mag on size and number of sw480 spheroids

2.3 Mag对sw480球体细胞CD133蛋白表达的影响收集各组球体细胞，球体免疫荧光检测细胞内CD133蛋白表达。结果表明，与对照组相比，Mag给药组球体细胞减小、荧光强度减弱，提示Mag抑制sw480球体细胞CD133蛋白表达（图2）。

图2 Mag对sw480球体细胞CD133蛋白表达的影响Fig.2 Effect of Mag on CD133 protein expression in sw480 spheroid cells

Note：Compared with Control group，**.P<0.01；***.P<0.001；****.P<0.000 1.

2.4 Mag对sw480细胞糖酵解的影响不同浓度Mag处理24 h后收集细胞，比色法分别检测细胞葡萄糖摄取及乳酸生成。结果表明，各组细胞葡萄糖摄取量分别为（10.32±1.12、7.11±0.86、4.60±0.75、2.93±0.31）nmol/μg。各组乳酸生成量分别为（7.62±0.69、5.57±0.59、3.95±0.47、2.25±0.28）nmol/μg。与对照组相比，Mag处理后，细胞葡萄糖摄取及乳酸生成均降低（P<0.01，P<0.001或P<0.000 1），提示Mag抑制sw480细胞糖酵解（图3）。

2.5 Mag对sw480细胞ROS水平的影响Mag处理后，流式细胞术结果显示，各组细胞内ROS平均荧光强度（×103）分别为53.44±3.76、38.20±3.17、21.94±3.10、13.00±5.66。与对照组相比，Mag给药组细胞内ROS水平降低（F=58.32，P<0.000 1），提示Mag抑制sw480细胞内ROS水平（图4）。

图4 Mag对sw480细胞ROS的影响Fig.4 Effect of Mag on ROS in sw480 cells

2.6 Mag对sw480细胞KRAS/AMPK信号通路的影响Mag及活性氧诱导剂（RA）处理后，收集细胞提取蛋白，Western blot检测细胞内KRAS/AMPK信号通路相关蛋白表达。结果显示，与对照组相比，Mag处理后细胞内KRAS和p-AMPK表达水平均降低（P<0.01）。与Mag组相比，Mag和RA联合处理组KRAS和p-AMPK表达水平升高（P<0.05）。提示Mag通过降低ROS水平抑制KRAS/AMPK信号通路（图5）。

图5 Mag对sw480细胞KRAS/AMPK信号通路的影响Fig.5 Effect of Mag on KRAS/AMPK signaling pathway in sw480 cells

3 讨论

尽管癌症治疗取得了重大进展，但患者的存活率仍然很低。标准抗癌疗法不充分的疗效和严重的副作用引起了研究者对天然药物的兴趣，以确定具有良好化疗性能的植物来源的生物活性化合物。Mag是一种广泛存在于多种植物中的四元阿朴啡生物碱，OKON等［5］发现Mag对肺癌、乳腺癌、胶质瘤和横纹肌肉瘤细胞均具有抑制作用。肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新、自我修复能力的永生化增殖性细胞亚群，与结直肠癌的转移、化疗耐药及复发密切相关［6-7］。WANG等［8］研究表明苍术内酯Ⅰ通过抑制肿瘤细胞干性发挥对结直肠癌的抗癌作用。本研究发现，Mag能够抑制sw480细胞活性及成球能力并下调其球体细胞中CD133的表达，表明Mag可能通过调控结直肠癌细胞干性特征抑制其增殖。

最近，代谢重编程被认为是癌细胞的核心特征，其中最受关注的有氧糖酵解也被称为Warburg效应。在糖酵解过程中，癌细胞增加葡萄糖消耗以满足快速生长所需的高能量和大分子需求，驱动癌细胞的恶性进展［9-10］。本研究发现Mag处理后，sw480细胞葡萄糖摄取及乳酸生成水平明显下降，表明Mag能够抑制结直肠癌细胞糖酵解。

与正常细胞相比，肿瘤细胞内存在更高水平的ROS，从而维持生物学活动。肿瘤细胞的过度增殖伴随高ROS的产生，尽管ROS具有一定的细胞毒性，但肿瘤细胞能够适应这种氧化负荷并茁壮成长。此外，肿瘤细胞通过增加其抗氧化状态以优化细胞内ROS水平，从而实现对增殖的促进，同时避免触发衰老、细胞凋亡或铁死亡［11］。MOLONEY等［12］研究表明癌细胞中高水平的ROS可通过减弱PTEN和MAPK磷酸酶活性来刺激增殖和细胞存活。为了维持高ROS水平对增殖的促进作用，同时降低衰老或细胞死亡的风险，肿瘤细胞通过多种方式上调抗氧化转录因子和/或重新编程代谢［11-12］。研究表明，癌细胞内ROS水平与干性特征及细胞代谢均密切相关［13］。致癌基因KRAS可诱导多种癌症的表型特征，包括干性特征增强及细胞代谢改变［14-15］。AMPK是一种保守的能量传感器，是细胞代谢的主要调节剂。研究表明，ROS/KRAS/AMPK信号能够促进吉西他滨诱导的胰腺癌干细胞特性中的作用［15］。本研究发现Mag能够抑制sw480细胞中的ROS水平，并通过抑制ROS抑制KRAS/AMPK信号通路，表明Mag能够抑制结直肠癌细胞中ROS/KRAS/AMPK信号通路。

综上所述，Mag能够抑制结直肠癌细胞sw480的干性特征及糖酵解水平，其机制可能与抑制细胞中ROS/KRAS/AMPK信号通路有关。