麻黄碱介导TSLP/OX40L通路调节变应性鼻炎大鼠Th2型免疫反应的作用研究

杨玲 刘杰 李江平 李鹤

（襄阳市中心医院耳鼻咽喉-头颈外科，襄阳 441021）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一种Ⅰ型超敏反应，源于特定过敏原的致敏作用，如家用尘螨、宠物和花粉［1-2］。免疫球蛋白E（IgE）介导的变应性鼻炎是一种以打喷嚏、鼻塞、鼻痒和鼻漏为特征的慢性疾病。这些症状是由IgE刺激的肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T淋巴细胞释放的各种炎症介质引起［3］。现有几种药物用于治疗变应性鼻炎，如抗组胺药、皮质类固醇、抗白三烯和鼻减充血剂。然而，在变应性鼻炎中长期使用这些药物可能会有不良副作用，且这些药物对部分患者的治疗效果并不理想。麻黄碱（Ephedrine）是一种存在于多种麻黄属植物中的生物碱，同时也是经典的α和β肾上腺素能激动剂，具有刺激中枢神经系统、升高血压和扩张支气管的作用［4］。目前，许多研究报道麻黄联合其他药物在变应性鼻炎中的治疗效果［5-6］。也有学者发现麻黄碱与丙酸氟替卡松联合使用对早期中重度持续变应性鼻炎具有较好疗效［7］，然而，麻黄碱治疗变应性鼻炎的具体分子机制尚不明确。辅助性T细胞2（Th2）及其释放的细胞因子如IL-4、IL-13等与变应性鼻炎的炎症反应密切相关［8］。胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）/OX40L与Th2细胞免疫应答密切相关，TSLP/OX40L是启动和维持变应性鼻炎中Th2型免疫应答的重要信号通路［9-10］。本研究的目的是考察麻黄碱对卵白蛋白（OVA）诱导的变应性鼻炎大鼠模型中Th2型免疫反应及TSLP/OX40L通路的影响，从而进一步揭示麻黄碱治疗变应性鼻炎的药理学作用。

1 材料与方法

1.1 材料从北京维通利华实验动物技术有限公司购买雌性SD大鼠40只，体质量200~250 g。大鼠在12 h光-12 h暗照明、室温（23±2）℃、湿度（45±5）%的环境中饲养，自由获取食物和水。

卵白蛋白（OVA）购自美国Sigma-Aldrich公司；麻黄碱购自吉林省辉南辉发制药股份有限公司，国药准字H22021712；总IgE、IL-4和IL-13 ELISA试剂盒购自上海心语生物科技有限公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；PrimeScript RT试剂盒、SYBR Prime Script RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；BCA试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。本研究所有抗体均购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、建模及药物治疗将雌性SD大鼠随机分为4组，对照组（Control）、模型组（Model）、麻黄 碱组（Ephedrine，10 mg/kg）和 氯雷 他 定 组（Loratadine，2 mg/kg），每组10只。除对照组外，其余组大鼠均建立OVA诱导的变应性鼻炎大鼠模型。将0.3 mg OVA和30 mg氢氧化铝溶解于生理盐水中，每隔1 d腹腔注射1次，连续14 d。致敏后第15~21天，每天激发1次，每鼻孔滴注10%OVA溶液20 μl（溶于1 ml生理盐水中），连续7 d。致敏后第15~21天，麻黄碱组大鼠每天灌胃10 mg/kg麻黄碱，氯雷他定组大鼠每天灌胃2 mg/kg氯雷他定，均连续给药7 d。

1.2.2 鼻部症状评分鼻部评分在研究第22天进行。大鼠单独放在笼子里，在经过10 min的适应期后，观察10 min内大鼠打喷嚏、挠鼻和流鼻涕［11］。每分钟打喷嚏次数：0分无、1分1~2次、2分3~5次、3分>6次；每分钟挠鼻次数：0分无、1分1~2次、2分3~5次、3分>6次；流鼻涕：0分 无、1分 单鼻孔、2分双鼻孔、3分涕流满面。总分超过5分即为造模成功。

1.2.3 ELISA分析所有大鼠在40 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪麻醉下颈椎脱位处死。眼底静脉丛取血，3 000 r/min离心10 min。分离血清，并将其冷藏于-80℃。使用相应的ELISA试剂盒检测血清总IgE、IL-4和IL-13水平。IgE以KU/L表 示、IL-4以pg/ml表示、IL-13以ng/L表示。

1.2.4 组织病理学分析将大鼠处死后，剪下鼻部并用4%多聚甲醛固定48 h，然后石蜡包埋，切成4 μm切片。按照制造商说明，对切片进行HE染色。

1.2.5 qRT-PCR分析用TRIzol试剂从大鼠鼻黏膜组织中提取总mRNA，PrimeScript RT试剂盒逆转录合成cDNA。使用SYBR Prime Script RT-PCR试剂盒在Applied Biosystems 7900HT荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR分析。引物序列如下，TSLP：5'-CTCCGGTATAGCACAATTC-3'（正向）和5'-TGCATACCGAGTCATAAG-3'（反向）；OX40L：5'-CCCATGTCTCGGCACCTATTAA-3'（正向），5'-ATGTCTGAATGAATGTCGGGGA-3'（反向）；β-actin：5'-CTGAAGAGATCTACGGGA-3'（正向），5'-GCATTGCTGC⁃TACCGTAACTGT-3'（反向）。反应条件：95℃3 min；95℃10 s、60℃30 s、72℃40 s，40个 循 环；72℃10 min。将TSLP和OX40L的mRNA水平标准化为β-actin，通过2-ΔΔCt方法计算mRNA相对表达量。

1.2.6 Western blot将大鼠鼻黏膜组织剪碎、研磨，使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解组织，12 000 g离心10 min。BCA试剂盒测定蛋白浓度。10%SDS-PAGE电泳分离蛋白（20 μg），并转移到聚偏氟乙烯膜上。使用含5%脱脂乳的TBST封闭膜2 h，将膜与TSLP（1∶1 000稀释）、OX40L（1∶1 000稀释）和β-actin（1∶2 000稀释）一抗4℃孵育过夜，随后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000稀释）室温孵育1 h。使用ECL化学发光试剂盒进行显影。

1.2.7 免疫组织化学分析鼻黏膜组织切片用PBS洗涤后，在3%H2O2中孵育10 min阻断内源性过氧化物酶活性。在500 W微波下用抗原修复液处理2次，每次5 min，将切片冷却。用PBS洗涤后，切片与PBS稀释的环氧合酶2（COX2）（1∶1 000稀释）一抗4℃过夜孵育。PBS洗涤后，将切片与辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG二抗（1∶1 000稀释）室温避光孵育1 h，PBS洗涤。然后DAB染色3~10 min，苏木精复染。每张切片随机选择6个高倍视野（200倍），计数100个视野中的细胞，并计算阳性细胞率。阳性细胞率=阳性细胞占细胞总数的百分比。

1.3 统计学处理SPSS21.0软件进行统计分析。正态分布检验后，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）和Tukey事后检验对正态分布的数据进行分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 麻黄碱对变应性鼻炎大鼠鼻部症状的影响各组大鼠的鼻部症状评分如图1所示，模型组大鼠的鼻部症状评分显著高于对照组（P<0.05），表示建模成功。与模型组相比，麻黄碱组和氯雷他定组的鼻部症状评分显著降低（P<0.05），说明麻黄碱和氯雷他定均能明显减轻变应性鼻炎大鼠的鼻部症状。

图1 各组大鼠的鼻部症状评分Fig.1 Scores of nasal symptoms of rats in each group

2.2 麻黄碱对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜组织病变的影响HE染色显示（图2），对照组大鼠鼻黏膜和黏膜下层组织结构正常，模型组大鼠出现鼻腔杯状细胞增生，鼻上皮纤毛脱屑，嗜酸性细胞浸润严重，鼻腔内有坏死的嗜酸性肿块。在黏膜下层观察到严重水肿、血管扩张和充血。麻黄碱组和氯雷他定组轻度杯状细胞增生，黏膜下层轻度水肿，血管轻度扩张。

图2 各组大鼠鼻腔组织的HE染色（×200）Fig.2 HE staining of rat nasal cavity tissues in each group（×200）

COX2是炎症反应的重要组分和标志物，本研究通过免疫组化染色检测了各组大鼠鼻黏膜组织中COX2的表达，如图3所示，模型组大鼠鼻黏膜组织中COX2阳性细胞率显著高于对照组（P<0.05）。与模型组相比，麻黄碱组和氯雷他定组大鼠鼻黏膜组织中COX2阳性细胞率显著降低（P<0.05）。结果说明麻黄碱和氯雷他定均能明显减轻变应性鼻炎大鼠的鼻黏膜组织病变。

图3 各组大鼠鼻黏膜组织中COX2的免疫组织化学染色（×200）Fig.3 Immunohistochemical staining of COX2 in nasal mucosa tissue of rats in each group（×200）

2.3 麻黄碱对变应性鼻炎大鼠Th2型免疫反应的影响由于Th2细胞免疫反应是通过释放细胞因子如IL-4、IL-13等进行抗原呈递的，并且IL-4和IL-13通过诱导产生IgE而导致过敏性炎症，因此，IL-4和IL-13的异常可直接反映Th2细胞免疫的激活与否。因此，本研究通过ELISA分析各组大鼠血清中IgE水平以及Th2型细胞因子IL-4和IL-13的水平，从而考察麻黄碱对变应性鼻炎大鼠Th2型免疫的影响。如图4所示，模型组大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平显著高于对照组（P<0.05）。与模型组相比，麻黄碱组和氯雷他定组大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平显著降低（P<0.05）。结果说明麻黄碱和氯雷他定均能明显抑制变应性鼻炎大鼠Th2型免疫反应。

图4 各组大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平Fig.4 Levels of IgE，IL-4 and IL-13 in serum of rats in each group

2.4 麻黄碱对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜组织TSLP/OX40L通路的影响通过qRT-PCR和Western blot分析各组大鼠鼻黏膜组织中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表达水平，如图5和图6所示，模型组大鼠鼻黏膜组织中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组（P<0.05）。与模型组相比，麻黄碱组和氯雷他定组大鼠鼻黏膜组织中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结果说明麻黄碱和氯雷他定均抑制了变应性鼻炎大鼠鼻黏膜组织中TSLP/OX40L通路的活化。

图5 各组大鼠鼻黏膜组织中TSLP和OX40L的mRNA水平Fig.5 TSLP and OX40L mRNA levels in nasal mucosa tissues of rats in each group

图6 各组大鼠鼻黏膜组织中TSLP和OX40L蛋白水平Fig.6 TSLP and OX40L protein levels in nasal mucosa tissues of rats in each group

3 讨论

据报道，麻黄碱通过PI3K/Akt途径增加抗炎细胞因子IL-10和降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的表达，从而控制炎症反应［4］。此外，在脂多糖（LPS）诱导的内毒素休克小鼠模型中，麻黄碱通过平衡TLR4信号中促炎细胞因子和抗炎细胞因子的产生来促进免疫稳态并发挥抗炎作用［12］。目前，许多研究报道麻黄联合其他药物在变应性鼻炎中的治疗效果［5-7］，然而，麻黄碱治疗变应性鼻炎的具体分子机制尚不明确。

变应性鼻炎发展过程中，炎症改变会导致鼻涕、瘙痒和打喷嚏等鼻部症状。随后是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞迁移到鼻黏膜的后期阶段［13］。在这种细胞流动中，嗜酸性粒细胞尤其会增加活性氧自由基（ROS）的产生，从而增加鼻黏膜的通透性并促进黏液的产生，降低上皮纤毛的功能，促进黏附分子的表达和炎症介质的释放。另外，COX2是花生四烯酸生成二十烷酸的原因，也是炎症反应的重要组成部分和标志物［14］。本研究显示，麻黄碱显著减少变应性鼻炎大鼠的鼻部症状，HE染色证实麻黄碱治疗后大鼠鼻黏膜内的炎症细胞浸润明显减轻，免疫组织化学染色显示麻黄碱抑制了鼻黏膜组中COX2的表达，并且麻黄碱的治疗效果与氯雷他定相当，说明麻黄碱在治疗变应性鼻炎方面具有较好的疗效。

Th2炎症反应是变态反应性炎症疾病的主要诱因。在变应性鼻炎的致敏阶段，鼻黏膜的过敏原接触T淋巴细胞，导致Th2淋巴细胞的出现。随着Th2淋巴细胞的激活，产生导致IgE合成和肥大细胞增殖的细胞因子，如IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13［15］。当肥大细胞表面的过敏原遇到自身的特异性IgE时，早期的炎症反应会导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质。这些物质包括IL-4、IL-6和COX2等介质，会引起鼻腔内的炎症过程。高IgE水平是变态反应性疾病存在的重要标志。WINTHER等［16］研究表明，季节性变应性鼻炎患者的IgE水平升高，这与鼻炎的严重程度有关。一项OVA诱导的变应性鼻炎模型的研究表明，大鼠血清IgE水平升高［11］。此外，与血清IgE水平一样，变应性鼻炎患者鼻黏膜局部IgE水平也升高［17］。IL-4和IL-13在变应性鼻炎中占有重要地位。这些Th2型细胞因子是淋巴细胞抗原呈递功能所必需的，还通过产生IgE而导致过敏性炎症［18］。IL-13在气道高反应性、嗜酸性粒细胞浸润和黏液纤毛分化中起重要作用。它还被证明能刺激鼻腔上皮细胞合成NO，从而加重血管扩张和呼吸道炎症［19］。其他文献报道，变应性鼻炎大鼠血清IgE、IL-4和IL-13水平明显高于对照组［11，20］。在花粉诱导的变应性鼻炎模型中，IgE、IL-4和IL-13的水平也同样升高［21］。本研究中，与对照组相比，变应性鼻炎大鼠血清IgE、IL-13和IL-4水平显著升高，然而麻黄碱治疗的大鼠血清IgE、IL-4和IL-13水平显著降低。

致敏细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP），是在上皮细胞和树突状细胞之间启动变态反应性炎症的主开关之一［22］。OX40与其配体OX40L是TSLP信号通路的下游分子，OX40L调控Th1和Th2细胞的分化过程。TSLP/OX40L是启动和维持变应性鼻炎中Th2型免疫应答的重要信号通路［10］。在过敏性炎症中TSLP能激活髓样树突状细胞（DC）产生OX40L，从而触发Th2炎症反应［23］。本研究结果显示，麻黄碱治疗后，变应性鼻炎大鼠鼻黏膜组织中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表达均被抑制。结果提示，麻黄碱可能通过TSLP/OX40L通路调节变应性鼻炎大鼠Th2型免疫应答，从而发挥治疗作用。

综上所述，本研究表明麻黄碱对OVA诱导的变应性鼻炎大鼠具有良好的治疗作用，麻黄碱可能通过TSLP/OX40L通路调节变应性鼻炎大鼠Th2型免疫应答，从而发挥治疗作用。