正交试验优化恒山黄芪多糖微波辅助提取工艺

梁泰帅 张 淼 姜佳琪

山西医科大学药学院，山西 太原 030001

黄芪是“十大晋药”中药材之一，在《中国药典》(2015年版)中规定为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气固表、利尿、降压、加强毛细管抵抗力等功效[1-3]。其中，主产于北岳恒山的恒山黄芪(也称为正北芪)品质最优，具有条匀顺直、药性强、粉性和甜味足、豆腥味浓等特点[4]。研究表明，多糖是发挥黄芪药效作用的功能性成分之一，具有增强免疫[5]、调节血糖[6]等多种药理作用。近年来，微波辅助提取技术被广泛应用于植物有效成分的提取过程中，其主要借助介电加热和离子传导作用进行物质的快速提取，具有节能、省时、高效、副产品少等优点[7]。目前微波辅助提取技术在晋产道地药材恒山黄芪多糖提取方面的应用尚未见报道，鉴于此，试验以恒山黄芪饮片为材料，首先采用单因素试验考察液固比(因素A)、提取次数(因素B)、微波时间(因素C)和微波功率(因素D)四个因素对黄芪多糖产率的影响，并通过L9(34)正交试验设计优选黄芪多糖的微波辅助最佳提取工艺，旨在为恒山黄芪资源的深度开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试药 恒山黄芪饮片购自山西浑源万生黄芪开发有限公司，经山西医科大学刘恩荔副教授鉴定为蒙古黄芪Astragalusmembranaceusvar.Mongholicus，60 ℃烘干后粉碎备用；无水葡萄糖(纯度≥98%)、苯酚、浓硫酸等试剂均为分析纯。

1.2 仪器 试验所需主要仪器见表1。

表1 试验仪器

1.3 方法

1.3.1 黄芪多糖的提取 黄芪多糖的提取按照魏增云等[8]的方法：准确称取黄芪粉末5 g和一定体积的纯化水于250 mL的三角瓶中，按照一定的微波条件(因素A、B、C和D)提取黄芪多糖，冷却至室温后离心，上清液即为供试品溶液。

1.3.2 标准曲线的制作及多糖产率的计算 标准曲线的制作按照王珊珊[9]和鲍慧[10]的方法(硫酸-苯酚法)，取7只 25 mL刻度试管分别精确加入葡萄糖对照品溶液(100 μg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，并向各试管添加纯化水至体积为2 mL，分别向各试管内加入5%的苯酚溶液(临用前配制)1 mL，混匀后快速加入浓硫酸5 mL，混匀后将全部试管放置沸水浴中显色15 min，取出后快速置于冰水中冷却，以 2 mL 的纯化水作试剂空白，在490 nm处测定吸光度，分别以吸光度(Y)和葡萄糖浓度(X，μg/mL)为纵、横坐标，拟合得回归方程为Y=0.0171X-0.0203，R2=0.9994。

精确吸取黄芪多糖供试品溶液1 mL按照上述硫酸-苯酚法“添加纯化水至体积为2 mL……取出后快速置于冰水中冷却”处理后测定吸光度，并代入回归方程计算多糖浓度，按照下式计算多糖产率：黄芪多糖产率(%)=浓度(μg/mL)×稀释倍数×提取液体积(mL)/[黄芪粉末质量(g)×106]×100。

1.3.3 精密度试验 准确吸取葡萄糖对照品溶液(100 μg/mL)1 mL，加纯化水补至体积为2 mL，按照“1.3.2”项下硫酸-苯酚法操作重复测定吸光度6次，结果RSD为0.92%，表明仪器精密度良好。

1.3.4 稳定性试验 准确吸取供试品溶液1 mL，加纯化水补至体积为2 mL，按照“1.3.2”项下硫酸-苯酚法操作，依次在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、24 h测定吸光度，结果RSD为0.48%，表明供试品溶液在显色后的24 h内稳定。

1.3.5 重复性试验 分别精确称取6份黄芪粉末5 g于250 mL的三角瓶中，按照“1.3.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，各取1 mL于25 mL刻度试管中并添加纯化水补至体积为2 mL，按照“1.3.2”项下硫酸-苯酚法操作测定吸光度，结果RSD为0.89%，表明此方法重复性良好。

1.3.6 加样回收试验 准确称取6份已知含量(14.274 mg/g)的黄芪粉末2.5 g，分别精确加入葡萄糖对照品35.7 mg，按照“1.3.1”项下方法制备供试品溶液和“1.3.2”项下硫酸-苯酚法操作测定吸光度，如表2所示，平均回收率为100.51%，RSD为1.13%，表明回收率结果较好。

表2 加样回收率试验结果

1.3.7 单因素试验 按照“1.3.1”项下供试品溶液制备方法和“1.3.2”项下硫酸-苯酚法，分别探讨液固比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，固定提取次数为2次、微波时间为15 min及微波功率为350 W)、提取次数(1、2、3、4、5次，固定液固比为20∶1、微波时间为15 min及微波功率为350 W)、微波时间(5、10、15、20、25 min，固定液固比为20∶1、提取次数为2次、微波功率为350 W)、微波功率(250、350、450、550、650 W，固定液固比为20∶1、提取次数为2次及微波时间为15 min)对黄芪多糖产率的影响。

1.3.8 正交试验设计 基于单因素试验结果，采用四因素三水平(表3)正交试验设计对黄芪多糖提取的条件组合进行优化。

表3 正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验 由图1可知，随着因素A、C、D的增加，黄芪多糖产率均呈先升后降趋势，且分别在因素A为20∶1、因素C为10 min和因素D为350 W时多糖产率达到最大值。当因素A超过 20∶1 时多糖产率下降可能是由于单位体积液料吸收的微波能降低而不利于黄芪细胞的破裂，导致多糖未能充分溶解出来，因素C和D超过10 min和350 W时多糖产率下降可能是由于较长的微波时间和较高的微波功率引起提取装置内温度过高，导致多糖结构遭到破坏。而随着因素B的增加，多糖产率显著增加，超过3次时多糖产率变化差异不明显，实际生产中提取次数过多既浪费溶剂又会降低提取效率[11]。因此综合选择设置20∶1、3次、10 min、350 W分别为因素A、B、C、D的最佳试验条件。

2.2 正交试验 由表4中R值(极差)可知，四个因素对黄芪多糖产率的影响程度依次为因素D、因素B、因素A和因素C，同时从表5可知，四个因素均显著影响黄芪多糖的产率。从表4中K1、K2、K3的大小分析得出，黄芪多糖微波辅助提取的最优条件组合为A2B2C2D3，即因素A设置为 20∶1，因素B设置为3次、因素C设置为10 min和因素D设置为450 W。

表4 正交试验设计及结果

表5 方差分析结果

2.3 验证试验 为验证L9(34)正交试验结果的可靠性，准确称取3份黄芪粉末(每份5 g)于 250 mL 的三角瓶中，分别在A2B2C2D3条件下进行3次平行提取试验，验证结果见表6，黄芪多糖平均产率为7.97%，均高于单因素试验和正交试验的多糖产率，表明通过L9(34)正交试验筛选获得黄芪多糖微波辅助提取的最优条件(A2B2C2D3)稳定合理。

表6 验证正交试验结果

3 讨论

试验通过微波辅助提取法，采用单因素试验和L9(34)正交试验得到恒山黄芪多糖微波辅助提取的最优条件组合为A2B2C2D3，在此提取条件下黄芪多糖的平均产率为7.97 %，要高于大多数文献报道[12-14]中的黄芪多糖产率。本试验确定的恒山黄芪多糖微波辅助提取工艺重复性和稳定性较好、操作简单且多糖产率较高，具有较大的实际生产指导价值，为恒山黄芪资源的深度开发利用奠定了理论基础。