香连丸对2型糖尿病大鼠早期肝损伤的保护作用

张志豪 李 竣 何志勇 石召华 黄先菊

1.中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074；2.中南民族大学实验教学与实验室管理中心，湖北 武汉 430074；3.武汉爱民制药股份有限公司，湖北 鄂州 436070

糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性代谢性疾病，其并发症是导致糖尿病患者致死致残的主要原因。过去人们对糖尿病的聚焦点主要在神经损害、血管损害及肾损害，而肝脏作为调节血糖最重要的器官，是参与机体糖代谢的重要组织之一。由于肝脏代偿功能较强且早期肝损伤不明显等因素，糖尿病肝损伤不易引起人们的关注。近年来，随着糖尿病发病率的急剧增高，糖尿病肝损伤的发病率也显著增高[1-4]。糖代谢紊乱容易导致高血糖症的发生，引起糖原在肝脏堆积并引发肝脏微血管病变，损伤肝功能，其中以非酒精性脂肪肝最为常见。

香连丸是治下痢的古代名方，可清热燥湿，行气止痛。中成药香连丸为黄连和木香以相使配伍的关系组成，处方均为黄连(吴茱萸制)与木香4∶1，用于湿热痢疾，里急后重，腹痛泄泻，菌痢，肠炎[5]。现代研究发现，香连丸可治疗胃溃疡[6]、腹泻[7]、溃疡性结肠炎[8]、及细菌性感染[9]等。但未见其对糖尿病引起的肝脏损伤的保护作用的相关报道。本研究采用高脂饮食联合小剂量STZ一次性腹腔注射建立2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus T2DM)大鼠模型，探讨香连丸对T2DM大鼠肝脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级Sprague-Dawley (SD)大鼠60只，体重160～180 g，购于华中农业大学实验动物中心，许可证号：SCXK-(辽)2015-0001。饲养于中南民族大学实验动物中心SPF动物房。实验动物基础饲料(武汉万千佳兴生物科技有限公司)；动物福利和实验过程符合美国国立卫生院(NIH)准则，并经中南民族大学伦理委员会(编号：SYXK2016-0089)批准[10]。实验温度20～25 ℃，湿度40%～70%，光照或者黑暗条件下让老鼠自由进食。为避免食物干扰，老鼠在实验前12 h禁食不禁水。

1.1.2 药物与试剂 香连丸(批号：20190404，湖北香连药业有限责任公司)；链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，批号：EZ2921B400，BioFroxx公司)；D12451高糖高脂饲料(批号：11126720000 33501，小黍有泰(北京)生物科技有限公司)；盐酸二甲双胍缓释片(批号：20181026，武汉爱心康大药房)；谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST，批号：140219005)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT，批号：140119007)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP，批号：1403190 05)、白蛋白(Albumin，ALB，批号：148319001)；γ-谷氨酰转移酶(Gamma glutamyltransferase，γ-GT，批号：141519008)；尿酸(Uric acid，UA，批号：141219004)；尿素(Urea，UREA，批号：141319002)；总胆固醇(Total cholesterol，TC，批号：141618014)；甘油三酯(Triglyceride，TG，批号：141719003)测定试剂盒均为武汉嘉晟瑞康科技有限公司；Rat TNF-α ELISA Kit试剂盒(批号：080620190709，上海碧云天生物技术有限公司)；Rat IL-6 ELISA Kit试剂盒(批号：20191011，武汉安特捷生物科技有限公司)；大鼠总超氧化物歧化酶(T-SOD)ELISA试剂盒(批号：MM-0731 R1，江苏酶免实业有限公司)；丙二醛(MDA)测试盒(批号：01910170，北京迈瑞达科技有限公司)；柠檬酸钠及柠檬酸、无水葡萄糖、乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 动物的造模、分组及给药 60只大鼠随机分出8只作为正常对照组，喂养普通饲料；其余52只大鼠喂养高脂饲料4周，然后一次性腹腔注射链脲佐菌素40 mg/kg，建立T2DM模型。正常组给予等体积枸橼酸缓冲液，1周后检测大鼠空腹血糖(Fasting billd glucose，FBG)，血糖浓度高于11.1 mmol/L的大鼠视为造模成功，确认糖尿病模型32只。将糖尿病成模的大鼠随机分为4组，分别为模型对照组、阳性对照二甲双胍组[11-12]、香连丸低剂量组和香连丸高剂量组，每组8只，正常组和模型组大鼠给予等体积生理盐水，二甲双胍组大鼠给予140 mg/kg二甲双胍，香连丸治疗组分别给予150 mg/kg和300 mg/kg香连丸灌胃，1次/d，共6周。

1.3 观察指标

1.3.1 一般情况 动物每周称重，密切观察动物精神状态、反应性、毛发色泽、饮食及排泄状况。称重，记录体重以及死亡情况。

1.3.2 空腹血糖和口服糖耐量(OGTT)实验 各组大鼠灌胃给予香连丸治疗6周后进行OGTT实验，实验前禁食12 h，尾静脉取血病检测空腹血糖水平，然后每只大鼠灌胃给予葡萄糖溶液2.5 g/kg，分别在给予葡萄糖后30，60，120 min采血，并测定血糖值(三诺安稳血糖仪及试纸条)，计算血糖曲线下面积(AUC)。血糖AUC=1/4×BG(0 min)+1/2×BG(30 min)+3/4×BG(60 min)+1/2×BG(120 min)。

1.3.3 血清中相关生化指标检测 末次灌胃给药后，大鼠禁食12 h，采用乌拉坦(100 mg/kg)进行麻醉，经腹主动脉取血，离心并分离血清，用全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，Mindray BS-240VET型)检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰胺转移酶(γ-GT)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、尿素(UREA)。试剂盒检测总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)。

1.3.4 TNF-α，IL-6含量检测 采用ELISA法检测大鼠血清TNF-α，IL-6含量。严格按试剂盒说明书步骤操作。

2 结果

2.1 一般情况 正常组大鼠健康状态良好，进食、饮水均正常，粪便成形，毛色光泽；模型组大鼠进食量增加、饮水增加、尿量增多、活动减少、精神萎靡，被毛蓬松无光泽；相较于模型组，二甲双胍组和香连丸低、高剂量组有明显改善。给予受试体样品干预期间，每周对实验大鼠的体重进行测定，实验结果如表1所示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠体重水平极显著性下降(P<0.01)；与模型组大鼠体重比较，二甲双胍组和香连丸低、高剂量组没有显著性差异。在整个治疗期间，正常组、模型组、二甲双胍组、香连丸低、高剂量组没有死亡。

表1 香连丸对实验大鼠体重的影响

2.2 香连丸对实验大鼠空腹血糖的影响 给予受试体样品干预期间，每周对实验大鼠的空腹血糖值进行测定，与正常组大鼠比较，模型组大鼠空腹血糖水平极显著性升高(P<0.01)。给予受试样品4周后，与模型组大鼠空腹血糖比较，二甲双胍组大鼠空腹血糖水平显著性下降(P<0.05)。见表2。

表2 香连丸对实验大鼠空腹血糖的影响

2.3 香连丸对实验大鼠糖耐量的影响 正常组、模型组、二甲双胍组以及香连丸低、高剂量组在葡萄糖灌胃后的60 min血糖达峰值，在接下来的60 min内，正常组血糖逐渐下降，在灌胃120 min后基本恢复到正常血糖值；而模型组血糖值缓慢下降，其血糖水平与正常组、二甲双胍组以及香连丸给药低、高剂量组相比较一直维持在较高水平。与正常组比较，模型组血糖曲线下面积(AUC)极显著性升高(P<0.01)。与模型组比较，香连丸高剂量组AUC显著性下降(P<0.05)。二甲双胍组、香连丸低剂量组AUC虽然低于模型组，但是无显著性差异。以上结果表明：模型组大鼠对葡萄糖耐受力下降，出现胰岛素抵抗，但是香连丸高剂量组可提高机体对葡萄糖的耐受量，改善胰岛素抵抗。见表3。

表3 各组大鼠糖耐量及AUC水平

2.4 对肝肾功能和血脂的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、UREA、TC、TG水平极显著性升高(P<0.01)，模型组大鼠血清中ALB-Ⅱ水平极显著性降低(P<0.01)。与模型组比较，二甲双胍组大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、UA水平极显著性降低(P<0.01)，二甲双胍组大鼠血清中ALB-Ⅱ水平显著性升高(P<0.05)；香连丸低、高剂量组大鼠血清中ALT、AST、γ-GT水平极显著性降低(P<0.01)，香连丸高剂量组大鼠血清中UA水平极显著性降低(P<0.01)，香连丸低、高剂量组大鼠血清中ALP、TC、TG水平显著性降低(P<0.05)，香连丸低、高剂量组大鼠血清中ALB-Ⅱ水平显著性升高(P<0.05)，香连丸低剂量组大鼠血清中UA水平显著性降低(P<0.05)。见表4、表5。

表4 香连丸对实验大鼠肝肾功能的影响

表5 香连丸对实验大鼠血脂的影响

2.5 对T-SOD、MDA水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清中的T-SOD水平极显著性降低(P<0.01)，模型组大鼠血清中MDA水平极显著性升高(P<0.01)。与模型组比较，二甲双胍组T-SOD水平显著性升高(P<0.05)，香连丸低、高剂量组极显著性升高(P<0.01)，二甲双胍组、香连丸低、高剂量组大鼠血清中MDA水平极显著性降低(P<0.01)。见表6。

表6 香连丸对实验大鼠血清中T-SOD、MDA的影响

2.6 对TNF-α、IL-6水平的影响 连续6周灌胃给药后发现模型组大鼠血清TNF-α的水平明显升高。与正常组比较，模型组大鼠血清中的IL-6、TNF-α水平极显著性升高(P<0.01)。与模型组比较，二甲双胍组IL-6水平极显著性降低(P<0.01)，二甲双胍组TNF-α水平显著性降低(P<0.05)。见表7。

表7 香连丸对实验大鼠血清中TNF-α、IL-6的影响

3 讨论

肝脏是调节糖代谢的重要器官，肝损伤是常见的糖尿病慢性并发症之一，糖尿病合并肝损伤时肝脏糖代谢出现紊乱，使血糖进一步升高，形成恶性循环[13]。高血糖会增加自由基的产生，并诱导氧化应激，从而引发肝脏损伤和碳水化合物代谢紊乱[14-15]。目前对糖尿病的治疗主要是以控制血糖、纠正糖代谢紊乱，减少及预防并发症为主[16]。

实验通过高脂饲料联合小剂量STZ腹腔注射的方法诱导制备T2DM大鼠模型。高脂饮食使大鼠体内产生胰岛素抵抗，再通过小剂量STZ腹腔注射破环部分胰岛β细胞，使其体内胰岛素分泌相对不足，造成T2DM大鼠模型。实验中大鼠出现多尿、多饮、多食及体重下降等临床表现。研究结果显示：香连丸可明显降低高脂饮食联合STZ诱导的糖尿病大鼠空腹血糖，改善糖耐量，显示出良好的治疗效果。

T2DM大鼠伴有肝功能异常主要表现为ALT、AST、ALP明显升高[17]，SD大鼠造模后，与正常组比较，模型组大鼠血清中AST、ALT、ALP水平极显著性升高，说明大鼠肝细胞受损严重。经过6周的治疗后，二甲双胍组和香连丸低、高剂量组大鼠血清AST、ALT、ALP水平有不同程度的下降。研究结果显示：香连丸对T2DM大鼠早期肝损伤具有保护作用。当肝细胞受损时，ALT和AST从胞浆释放入血，血清中这两种酶的活性在短时间内升高，由此判断肝细胞损伤程度[18]。

MDA水平可直接反映机体细胞自由基损伤程度。SOD是机体内对抗氧化自由基重要蛋白酶，在清除超氧阴离子以及调节体内氧化与抗氧化平衡方面起着主要作用，是机体内抗氧化与抗氧化平衡方面起着关键性的作用[19]。胡爱明等[20]采用小剂量STZ建立糖尿病模型，发现模型组大鼠血液和肝组织MDA明显增高，SOD等抗氧化酶的活性却降低，证实糖尿病肝组织也存在着明显的氧化应激，这些氧化应激导致组织和细胞的损伤。经过6周的治疗后，二甲双胍组和香连丸低、高剂量组大鼠血清MDA水平有不同程度的下降，T-SOD水平均高于模型组。结果显示：模型组大鼠血液的MDA明显增高，T-SOD抗氧化酶的活性却降低，说明香连丸可能通过抑制细胞内脂质过氧化反应进而减轻糖尿病肝损伤。

炎症细胞因子如TNF-α、IL-6水平的升高与糖尿病严重程度有关[21]，减轻炎症可以改善胰岛素抵抗。研究结果显示：模型组大鼠血清IL-6、TNF-α水平升高，二甲双胍组和香连丸低、高剂量组大鼠血清炎症因子有不同程度的下降，表明香连丸可通过抑制炎症反应来保护受损肝细胞。

综上所述，香连丸能够降低血糖，改善糖耐量，同时也能够调节血脂的TC和TG，以及增强机体的抗氧化能力，对糖尿病早期肝损伤具有一定的保护作用。