针刺透穴法对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经损伤及坐骨神经细胞凋亡相关蛋白表达的影响

李 雯，胡俊威，金 珠

(1. 上海中医药大学附属第七人民医院,上海 200137；2. 上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是2型糖尿病的并发症之一，也是最常见的神经病变原因。该病临床症状包括感觉障碍和肢体改变，感觉障碍主要表现为麻木、疼痛、袜套样感觉和四肢烧灼感等[1]。有学者对美国、英国等14个不同国家2型糖尿病患者的DPN患病率进行统计发现，DPN在不同国家的总体患病率约为26.71%[2]。DPN的发病机制尚不清楚且十分复杂，包括糖脂代谢紊乱、氧化应激反应、微血管异常、免疫炎症异常等，其中氧化应激反应是造成DPN等神经病变的重要原因。有研究表明，高糖状态可导致细胞凋亡异常[3]，凋亡细胞中抗凋亡基因Bcl-2表达减少，促凋亡基因Bax表达增加，而抑制细胞凋亡可以预防糖尿病氧化应激引起的神经损伤[4]。文献研究显示，针灸治疗是一种综合疗法，可改善DPN患者四肢麻木、疼痛、感觉紊乱、周围神经传导速度，可促进周围神经损伤后功能的恢复，且可以降低坐骨神经中Bax表达和升高Bcl-2表达[5-7]。但关于针刺透穴法调节DPN大鼠坐骨神经细胞凋亡、修复坐骨神经损伤的实验研究较少，因此本实验进行了相关研究，旨在为针刺透穴法用于DPN的治疗提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠18只，体重180～200 g，由北京维通利华实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证编号：SCXK(京)2016-0011。大鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心，饲养环境安静、清洁，室内恒温(22±2)℃，湿度60%～70%，每日光照12 h，自由摄水饮食。本实验方案已通过上海中医药大学动物实验伦理委员会审查(PZSHUTCM201030022)，操作均符合实验动物伦理标准。

1.2主要仪器与试剂 毫针(0.25 mm×25 mm，苏州华佗医疗器械有限公司)，华佗牌SDZ-V型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)，血糖仪(德国罗氏公司)，脱水机、包埋机(JJ-12J、JB-P5，武汉俊杰电子有限公司)，病理切片机(RM2016，德国徕卡仪器有限公司)，可调型移液器(德国Eppendorf公司)，Nikon DS-U3成像系统、Nikon Eclipse C1光学显微镜(日本尼康仪器有限公司)，小垂直板电泳槽(美国bio-rad公司)，超灵敏多功能成像仪(美国GE公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、QuickBlock Western封闭液(中国碧云天公司)，RIPA裂解液、凝胶快速配制试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)；D12451高糖高脂饲料(北京科奥协力公司)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，Anti-Bax抗体(250280，成都正能生物公司)，Anti-Bcl-2抗体(250198，成都正能生物公司)。

1.3实验方法 所有大鼠适应性喂养1周后，随机选取6只作为空白组，给予维持饲料喂养6周后腹腔注射缓冲液；其余12只大鼠参考Davidson等[8]和何姣等[9]的造模方法建立DPN模型，即给予高糖高脂饲料喂养6周后，腹腔注射35 mg/kg的STZ缓冲液(pH 4.1)，注射后48 h随机血糖大于16.7 mmol/L即认为造模成功。将成模大鼠随机分为模型组和电针组，每组6只。将电针组大鼠在自制鼠架上固定针刺，参照《实验针灸学》[10]常用动物穴位定位法，将毫针从阴陵泉透刺到阳陵泉、内关透刺到外关，并连接电针治疗仪，波形选取疏密波，频率2 Hz，电流强度以刺激部位皮肌微颤为度，20 min/次，隔日1次，共干预7次。空白组和模型组大鼠不予电针干预，仅同样捆绑处理。

1.4观察指标及检测方法

1.4.1血糖水平 干预结束后，采用3%戊巴比妥钠(0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，尾静脉取血用于检测血糖水平。

1.4.2坐骨神经病理形态 取部分左侧坐骨神经组织，固定在4%多聚甲醛溶液中，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制备5 μm切片。将切片放入2个装有二甲苯的玻璃容器中各10 min，然后放入2个有水或无水乙醇的玻璃容器中各3 min，再放入95%无水乙醇和75%乙醇的玻璃容器中各3 min，用自来水冲洗。切片放入苏木精染料中约10 min，自来水冲洗，75%盐酸分化30 s，自来水冲洗至细胞核变蓝;用伊红染色约5 min，用水轻度漂洗。将切片依次放入3个含75%乙醇、95%乙醇和无水乙醇的玻璃容器中各1 min，再放入2个含二甲苯的玻璃容器中各5 min。干燥后，用中性胶密封。最后在显微镜下采集并分析图像。

1.4.3坐骨神经中Bax和Bcl-2 表达情况

1.4.3.1Western blot法检测 将保存在-80 ℃冰箱中的大鼠坐骨神经组织粉碎，离心，加入RIPA裂解液。冰解后收集上清，离心提取，BCA试剂盒测定蛋白浓度。每孔取20 μg蛋白样品，聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩凝胶60 V电压，120 min；分离胶120 V电压，120 min)。将分离的蛋白电转移到PVDF膜上(250 mA电流，60 min)。转膜后，将膜面朝上，切膜后用TBS清洗1次。室温密封1 h后，TBST清洗5次，每次3 min，加入抗Bax一抗(浓度约为1∶2 000)和抗Bcl-2一抗(浓度约为1∶800)，4 ℃孵育过夜。次日TBST清洗 5次，每次3 min后加入二抗(浓度为1∶500)。细胞在室温下孵育1 h。TBST清洗5次，每次3 min。按说明配置ECL发光溶液，混合均匀后滴在胶片上，成像仪检测并计算灰度值。

1.4.3.2免疫组化染色法检测 石蜡切片脱蜡至水后进行抗原修复，自然冷却后PBS清洗，旋转干燥后3%的BSA密封，取出BSA溶液。分别加入抗Bax一抗(浓度约为1∶200)和Bcl-2一抗(浓度约为1∶200)覆盖组织，4 ℃孵育过夜。次日，PBS洗净，加入相应品种50～100 μL二抗，室温孵育50 min。PBS清洗后，加入50～100 μL新鲜DAB溶液配制DAB溶液，显微镜控制颜色。完全显色后，用流动水冲洗3次，梯度乙醇脱水。最后将薄膜密封，在显微镜下观察并采集图像。每只大鼠随机选取3个切片，每个切片观察3个区域，计算平均光密度值并取平均值。

1.5统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计量数据组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠血糖比较 空白组、模型组和电针组大鼠血糖水平分别为(5.64±0.29)mmol/L、(23.49±3.97)mmol/L、(24.15±4.06)mmol/L，模型组和电针组均明显高于空白组(P均<0.05)，模型组和电针组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组大鼠坐骨神经组织病理形态学表现 空白组大鼠坐骨神经组织结构正常，神经纤维排列紧密，髓鞘覆盖；模型组大鼠坐骨神经组织结构异常，大量神经纤维水肿，髓鞘结构脱落缺失成空泡状；电针组大鼠坐骨神经组织结构轻度异常，神经纤维排列疏松，个别可见髓鞘缺失脱落。见图1。

图1 空白组和糖尿病周围神经病变各组大鼠坐骨神经HE染色表现(×400)

2.3各组大鼠坐骨神经中Bax和Bcl-2蛋白表达情况 与空白组比较，模型组大鼠坐骨神经中Bax蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，电针组大鼠坐骨神经中Bax蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。见图2。

图2 空白组和糖尿病周围神经病变各组大鼠坐骨神经中Bcl-2、Bax蛋白表达情况

2.4各组大鼠坐骨神经中Bax和Bcl-2免疫组化表达情况 与空白组比较，模型组大鼠坐骨神经中Bax平均光密度值明显升高(P<0.05)，Bcl-2平均光密度值明显降低(P<0.05)；与模型组比较，电针组大鼠坐骨神经中Bax平均光密度值明显降低(P<0.05)，Bcl-2平均光密度值明显升高(P<0.05)。见图3及图4。

图3 空白组和糖尿病周围神经病变各组大鼠坐骨神经中Bax免疫组化表达情况(×400)

图4 空白组和糖尿病周围神经病变各组大鼠坐骨神经中Bcl-2免疫组化表达情况(×400)

3 讨 论

DPN因发病机制不明，目前治疗效果不理想，因此寻找治疗DPN的有效方法具有重要意义。糖尿病属于中医“消渴”范畴，DPN属于“痹证”和“痿证”范畴。糖尿病患者肾阴亏虚已久，阴损及阳，肾之阴阳两虚，进而导致气血运化失司，水液代谢失调，气滞、血瘀、痰邪阻滞经络而发病[11]。导师陈跃来教授从《素问·阴阳应象大论》“故善用针者，从阴引阳，从阳引阴”理论出发，结合经穴的特异性，形成了以内关透外关、阴陵泉透阳陵泉为主的针刺透穴法，在针刺阴经穴位的同时，透刺到阳经穴位，激发阴阳两经气血，使机体经脉气血通畅，达到“从阴引阳，阴中求阳”的目的，并使针感传导以达气至病所，临床治疗DPN收获良效[12]。但该疗法治疗DPN的机制尚不明确，本实验从细胞凋亡角度探讨了该疗法的作用机制。

细胞凋亡是机体调控细胞过度增殖以维持平衡的一种细胞功能，而DPN的发病与细胞凋亡密切相关[13]。长期的高糖状态会导致细胞钙稳态的破坏，诱导氧化应激反应，而氧化应激反应是导致细胞凋亡的重要环节[14]。细胞凋亡可引起DNA氧化损伤和蛋白表达异常。Bcl-2原癌基因位于细胞线粒体膜上，其高表达可抑制细胞凋亡；促凋亡蛋白Bax主要定位于细胞质中，介导下游凋亡分子的释放，可直接抑制Bcl-2蛋白的抗凋亡作用，阻止Bax同源寡聚体的形成，触发细胞凋亡[15]，Bcl-2表达减少和Bax表达增加可导致坐骨神经髓鞘损伤和痛觉过敏[16]。

本实验结果显示，模型组大鼠血糖水平和坐骨神经中Bax蛋白相对表达量及平均光密度值均明显升高，坐骨神经中Bcl-2蛋白相对表达量及平均光密度值均明显降低，坐骨神经髓鞘结构缺失异常,说明抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax相互作用，参与DPN大鼠坐骨神经损伤的病理过程；与模型组比较，电针组血糖水平变化不明显，坐骨神经中Bax蛋白相对表达量及平均光密度值均明显降低，坐骨神经中Bcl-2相对表达量及平均光密度值均明显升高，坐骨神经髓鞘结构损伤程度较轻，说明电针可通过上调Bcl-2的表达和下调Bax的表达，抑制坐骨神经细胞凋亡，与高睿琦等[17]研究结果一致。

综上，针刺透穴法可修复DPN大鼠坐骨神经损伤，作用机制与上调Bcl-2的表达和下调Bax的表达，抑制细胞过度凋亡相关，一定程度上为临床针刺透穴法治疗DPN提供了指导。但本研究存在以下局限性：未设阳性药物对照组，有待比较针刺与药物治疗DPN的疗效；神经细胞受损后发生凋亡的机制涉及众多途径，如PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT信号通路等，因此可考虑在下一步实验中将凋亡相关蛋白与信号通路相联系，发现针刺介导坐骨神经细胞凋亡的信号通路，更深入探讨针刺抗凋亡继而修复坐骨神经损伤的信号转导机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。