健脾理气活血方对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病的保护作用

刘梦瑶，张贺芳，牛明明，申英鸽

(1. 河北中医学院第一附属医院，河北 石家庄 050013；2. 邯郸市中西医结合医院，河北 邯郸 056001)

2型糖尿病是临床常见的内分泌疾病，中国成年人中其患病率已达12.8%[1]，自身胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗是该病发生的重要机制。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)以肝脏脂肪蓄积伴胰岛素抵抗为特点，其与2型糖尿病存在相同或者相似病因，目前NAFLD尚无针对性疗效确切的治疗药物。叉头转录因子O1(FoxO1)是胰岛素信号通路磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)的重要组成部分，广泛存在于肝细胞和脂肪细胞中[2]。肝脏中胰岛素与其受体结合，级联相关胰岛素通路激活[3]，肝脏糖脂异常代谢会损伤自身细胞，胰岛素受体底物因肝细胞破坏而减少，其募集下游信号分子能力减弱，作为第二信使的PI3K活性减弱，活化Akt能力降低，FoxO1磷酸化作用减弱，FoxO1从细胞核移至细胞质受阻，未能封闭核定位信号[4]，自身转录活性增强[5]，继而促进糖异生关键酶启动子和转录因子葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)等表达[6]，G-6-Pase过度表达可使大量葡萄糖-6-磷酸转化成葡萄糖释放入血，升高血糖，加重胰岛素抵抗，促进糖异生[7]。此外，激活状态下FoxO1会增加肝细胞对脂肪酸的摄入，加重肝脏脂质沉积[8]。中医认为脾虚瘀滞是NAFLD临床常见证型，中医药治疗2型糖尿病伴NAFLD显示出较好疗效。本实验旨在通过观察健脾理气活血方对2型糖尿病伴NAFLD大鼠肝功能、糖脂代谢及FoxO1通路相关因子蛋白表达的影响，探究该方的作用及可能作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠30只，7周龄，体重(175±25)g，购于河北医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。饲养于河北医科大学免疫教研室动物实验中心，保持室内通风，温度稳定于20～25 ℃，湿度控制为56%，明暗各12 h交替，自由摄食饮水，垫料适时更换清理。普通饲料适应性喂养1周后开始实验。实验研究经河北省中医院医学伦理委员会审核通过(2018-科研-80)。

1.2实验药物 健脾理气活血方，组成：黄芪30 g、党参15g、茯苓15g、炒白术12g、甘草6g、当归12 g、川芎12 g、丹参12 g、柴胡12 g、蜈蚣2条、白豆蔻12 g、木香9 g、绞股蓝12 g、五味子12 g、葛根9 g。上述药材来自广州市一方中药材有限公司，购于河北省中医院中药房，批号：9020723，颗粒剂型。

1.3试剂及仪器 FoxO1(货号：18592-1-AP)，G-6-Pase(货号：bs-21524R)，胰岛素受体底物1(IRS1，货号：AF6273)，beta Actin 抗体(货号：AF7018)，二抗[Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP，货号:S0001]；电泳槽(型号：JY-SCZ2+，北京君意)，电泳仪(型号：JY300HE，北京君意)，冷冻高速离心机(型号：Fresco17，德国Trermo Electron LED GmbH)，冷冻研磨机(型号：JXFSTPRP-CL-24，上海净信)，化学发光凝胶成像系统(型号：MiNiChemi 610 Plus，北京赛智)，恒温金属浴(型号：HDB-1，北京昊诺斯)，恒温培养振荡器(型号：ZWY-200D，上海智城)，雪花制冰机(型号：DTY-ZBJ-85，上海金鹏)，摇床(型号：SK-R1807-E，美国赛洛捷克)。

1.4实验方法 随机选取10只大鼠作为正常组，全程以普通饲料喂养；余20只大鼠给予高糖高脂饲料喂养4周后，禁食不禁水12 h，予30 mg/kg链脲佐菌素腹腔注射，正常组大鼠予同等剂量的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。以空腹血糖(FPG)≥11.1 mmol/L且大鼠多饮多食多尿为2型糖尿病造模成功[9]。然后造模大鼠继续予高糖高脂饲料喂至第8周末，随机抽取1只造模大鼠处死，以HE染色见肝细胞出现肿胀变形且有广泛大泡样脂肪变性为2型糖尿病伴NAFLD造模成功。依随机数字表法将成模大鼠分为模型组10只和中药组9只。根据临床成人用药量和《中药药理研究方法学》[10]，计算大鼠健脾理气活血方灌胃量为17.1 g/(kg·d)。从第9周开始，中药组给予健脾理气活血方灌胃，正常组和模型组给予同等剂量蒸馏水灌胃，均1次/d，连续灌胃16周。

1.5标本采集 末次灌胃后禁食不禁水12 h，次日测定各组大鼠体重和FPG，予10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后腹主动脉取血，4 ℃离心机离心，取上清分装并做好标记，-80 ℃冰箱保存，用于相关生化指标检测；充分暴露腹腔，剪断肝门静脉，取出完整肝脏，剪下1～2 mm厚肝组织制作石蜡标本，用于HE染色，剩余组织立即装入冻存管，移入提前准备的液氮中，转至冻存盒再置于-80 ℃冰箱保存，用于油红O染色和Western blot检测。

1.6观察指标与方法

1.6.1大鼠一般行为状态 实验过程中观察记录各组大鼠饮食、进水、排便情况及皮毛状态、精神状态等。

1.6.2肝功能、胰岛功能、血脂指标 依据生化试剂盒说明依次检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、FPG、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HbAlc)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，根据公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)。

1.6.3肝脏组织中G-6-Pase、FoxO1、IRS1蛋白表达情况 于冰上操作，取相应肝脏组织进行研磨裂解，离心后取上清-20 ℃保存。BCA法测蛋白质浓度，96孔板上样，酶标仪测定吸光度，波长设置为562 nm，依据标准曲线计算蛋白浓度，稀释后配平。取干净玻璃板配8%分离胶和5%浓缩胶，插入梳子。板、胶轻置于电泳槽中，倒入电泳液没过梳齿，拔出梳子整理上样槽，上样Marker及蛋白，1xbuffer补齐。补电泳液，根据正负极连接电泳仪，电压设置为80 V，约30 min后条带到达浓缩胶与分离胶交界处，调整电压为120 V，溴酚蓝移动距胶底大约1 cm时停止电泳。切需要部分胶，裁剪PVDF膜，在夹板上按顺序放置物品，于转膜槽中加转膜液，电流220 mA转膜90 min。于5%脱脂奶粉中封闭2 h。稀释一抗孵育过夜,TBST洗3次；稀释二抗孵育2 h,TBST洗3次。准备好化学发光检测的试剂，置PVDF膜于显影液中反应，放入化学发光凝胶成像系统进行显影、拍照，采用Image J软件测定目标条带的灰度值。

1.6.4肝脏组织HE染色观察 取制备好的蜡块切片，常规脱蜡冲洗，苏木素染核，水洗后乙醇分化，流水冲洗，进行梯度脱水，伊红染色数秒，再进行各梯度乙醇脱水，用二甲苯使之透明，滴树胶于透明切片上，盖片，镜检分析。

1.6.5肝脏组织油红O染色观察 使用冰冻切片机将冰冻肝组织切成6 μm厚切片，复温干燥，固定液中固定15 min，自来水洗，晾干。油红染液浸染8～10 min(加盖避光)，蒸馏水洗。取75%乙醇稍予进行背景分化，蒸馏水洗。苏木素染液染3～5 min，自来水洗；分化液进行分化，自来水洗；返蓝液返蓝，流水冲洗。从60 ℃烤箱中取出甘油明胶，对切片进行封片，显微镜下采集图像分析。

2 结 果

2.1各组大鼠一般行为状态 正常组大鼠一般状态良好，正常饮食水，二便未见明显异常，皮毛整洁柔顺，爪甲颜色红润，活动灵敏。模型组大鼠体重先增加后减轻，伴随多饮、多食，排泄次数增加且质溏，皮毛黄暗沉坠缺少光泽，精神状态不佳，少动易惊，爪甲暗淡温低，符合脾虚瘀滞的中医辨证表现，其中1只大鼠于饲养第18周末死亡，推测原因可能是血糖过高引起脏器损伤。中药组大鼠体重浮动较模型组小，多饮、多食、多尿、便溏症状减轻，皮毛白黄柔顺，稍显粗糙，精神状态可。

2.2各组大鼠肝功能指标比较 模型组大鼠血清ALT、AST水平均明显高于正常组(P均<0.05)，中药组大鼠血清ALT、AST水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各组大鼠血清肝功能指标比较

2.3各组大鼠胰岛功能指标比较 模型组大鼠血清FPG、FINS、HbAlc、HOMA-IR均明显高于正常组(P均<0.05)，中药组大鼠血清FPG、FINS、HbAlc、HOMA-IR均明显低于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各组大鼠血清胰岛功能指标比较

2.4各组大鼠血脂指标比较 与正常组比较，模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均明显增高(P均<0.05)，HDL-C水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，中药组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均明显降低(P均<0.05),HDL-C水平明显增高(P<0.05)。见表3。

表3 正常组和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各组大鼠血脂指标比较

2.5各组大鼠肝脏组织中G-6-Pase、FoxO1、IRS1蛋白表达情况 与正常组比较，模型组大鼠肝脏组织中G-6-Pase、FoxO1蛋白相对表达量均明显增高(P均<0.05)，IRS1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，中药组大鼠肝脏组织中G-6-Pase、FoxO1蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),IRS1蛋白相对表达量明显增高(P<0.05)。见图1及表4。

图1 正常组和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各组大鼠肝脏组织中G-6-Pase、FoxO1、IRS1蛋白表达情况

表4 正常组和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各组大鼠肝脏组织中G-6-Pase、FoxO1、IRS1蛋白相对表达量比较

2.6各组大鼠肝脏组织HE染色病理学形态 正常组大鼠肝脏细胞较圆，细胞核居中，细胞环绕中央静脉呈放射状排列，肝索条理清晰，肝小叶构成整齐；模型组大鼠肝脏细胞肿胀、体积增加，细胞核位置偏移、染色变浅或消失，胞浆中存在较多脂肪空泡与炎性浸润，肝小叶失去原有结构；中药组大鼠肝脏细胞肿胀较模型组轻，脂肪空泡散在于胞质中，炎性浸润减少，肝小叶结构趋于正常。见图2。

图2 正常组和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各组大鼠肝脏组织HE染色病理形态(×200)

2.7各组大鼠肝脏组织油红O染色病理学形态正常组大鼠肝细胞内未见明显橘红色脂滴；模型组大鼠肝细胞内可见广泛分布的红色脂滴，相近肝细胞内脂滴融合成大泡状，肝脏脂肪变性明显；中药组大鼠肝细胞内红色脂滴明显较模型组少。见图3。

图3 正常组和2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝病各组大鼠肝脏组织油红O染色病理形态(×200)

3 讨 论

在综合生活环境改变的影响下，2型糖尿病合并NAFLD的发病率明显增高，且有低龄化趋势[11]。2型糖尿病合并NAFLD患者存在胰岛素抵抗及多种代谢异常，其中NAFLD形成与胰岛素抵抗和脂肪代谢异常相关，胰岛素抵抗导致游离脂肪酸代谢异常，TG堆积形成单纯性脂肪肝，病变部位在肝小叶；后期发展使更多脂肪聚积于肝脏，肝细胞水肿，肝细胞在一系列氧化应激过程中受到损伤而发生肝炎[12]，释放大量ALT、AST入血[13]，导致肝功能异常，肝脏调控糖原合成分解及糖异生障碍，出现血糖升高等现象[14]。另外长时间肝脂肪变性降低自身对胰岛素的敏感程度，胰岛素分泌增加，导致高胰岛素血症。有实验证实，敲除FoxO1基因可以降低小鼠发生糖尿病及脂肪肝的概率[15]。本实验结果显示，模型组大鼠血清ALT、AST、FPG、FINS、HbAlc、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平及肝脏组织中G-6-Pase、FoxO1蛋白相对表达量均明显升高，血清HDL-C水平及肝脏组织中IRS1蛋白相对表达量均明显降低；HE染色示肝细胞胞浆中有较多脂肪空泡，存在炎性浸润；油红O染色见肝细胞中存在大量红色脂滴。说明2型糖尿病伴NAFLD大鼠存在糖脂代谢异常、胰岛素抵抗及FoxO1通路相关因子表达异常。

中医学认为糖尿病和NAFLD的病位在脾、在肝，脾阳虚不能运化水湿，生痰浊入络而致瘀滞，阻遏气机运行停滞于肝。健脾理气活血方为多年临床总结经验方，组方以党参、茯苓、白术为君药，可益气、健脾燥湿，鼓动中焦之气机。臣药黄芪补气升阳，生津而又养血，行滞通痹以活经络；当归、川芎、丹参行气通经，补血活血，通气络而不夺给养，消瘀滞又不伤肝脾；甘草补益脾胃，调和药性。佐药蜈蚣通经活络，通达四肢经络，可作载舟疏通全身经脉，予它药通路；柴胡升阳举气，疏肝胆之经脉，助脾行运化；白豆蔻、木香辛温发散，行气化湿，温中焦，调脾胃；绞股蓝养阴补虚，益气健脾；五味子可益气生津。使药葛根辛凉，可缓中焦瘀积之内火，生津升阳而通经络。全方相辅相成，不离脾虚瘀滞之病机。现代药理学研究表明，羧甲基茯苓多糖可改善肝损伤小鼠代谢障碍，促进肝细胞再生[16]；当归注射液能显著降低非酒精性脂肪肝大鼠血清ALT、AST水平，抑制肝脏脂肪沉积，可保肝抗炎[17]；丹参可以加速肝脏细胞修复[18]；黄芪多糖可减轻肝脏缺血再灌注损伤[19]，且有胰岛素增敏作用[20]；党参提取物可降脂控糖，减轻胰岛素抵抗，延缓糖尿病进展[21-23]；白术糖复合物可以减少糖尿病大鼠饮水和耗食量，并在一定程度上抑制胰腺萎缩[24]；五味子多糖可改善大鼠胰岛素抵抗[25]；葛根可降低血糖血脂，促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗[26]。本实验结果显示，与模型组比较，中药组大鼠血清ALT、AST、 FPG、FINS、HbAlc、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平及肝脏组织中G-6-Pase、FoxO1蛋白相对表达量均明显降低，血清HDL-C水平及肝脏组织中IRS1蛋白相对表达量均明显升高，且大鼠肝脏细胞肿胀减轻，脂肪空泡、炎性浸润、胞浆内脂滴均明显减少。提示健脾理气活血方可改善2型糖尿病伴NAFLD大鼠糖脂代谢及胰岛素抵抗，调节FoxO1通路相关因子表达，促进损伤肝细胞修复。

综上所述，健脾理气活血方能够改善2型糖尿病伴NAFLD大鼠糖脂代谢，减轻脂肪肝病变，分析与该方可调控FoxO1相关通路、减轻胰岛素抵抗有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。