补肾活血化痰方对COPD大鼠Wnt/β-catenin信号通路及气道重塑的影响

左然芹，朱慧志，刘向国，任冯春，徐晴雯

(1. 安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2. 安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是因慢性炎症、气道重塑等因素而导致的以气流受限为特征的疾病[1]。在COPD的早期就存在炎症细胞浸润、上皮损伤、小气道狭窄与管周纤维化导致的气道重塑，控制炎症、减缓气道重塑以预防COPD进行性加重，改善患者预后一直是研究的重点与难点[1-2]。研究表明，转化生长因子β1(TGF-β1)和血小板衍生生长因子(PDGF)是高效的促纤维化因子，肺成纤维细胞、气道平滑肌细胞是其主要的效应细胞，二者可通过促进效应细胞增殖，诱导细胞外基质沉积、纤黏蛋白及胶原合成增多等途径介导气道重塑过程[3-4]。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路可通过参与细胞外基质沉积、气道平滑肌细胞增殖，从而促进COPD气道重塑[5-6]。本研究通过观察补肾活血化痰方(阳和平喘颗粒)对COPD模型大鼠Wnt/β-catenin信号通路及气道重塑的影响，以期为该方治疗COPD提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠48只，体重(180±20)g，由安徽医科大学实验动物管理中心提供，生产许可证号：SCXK(豫)2019-0002，在可自由饮水摄食清洁的环境中适应性喂养1周后用于实验。本实验经安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准(AHUCM-rats-2021131)。

1.2实验药物 阳和平喘颗粒(由麻黄6 g、葶苈子10 g、白芥子10 g、桔梗10 g、旋覆花9 g、熟地15 g、巴戟天10 g、五味子6 g、当归10 g组成，安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供配方颗粒，10 g/包，每克含生药量2.7 g，生产批号：20190718)，桂龙咳喘宁胶囊(桂龙药业，生产批号：20170820)，均用生理盐水配置成相应浓度的混悬液。

1.3主要实验仪器及试剂 动物烟熏箱(自备)；实时定量PCR仪(Biorad公司)；离心机(ePPendorf公司)；通用电泳仪、蛋白转膜仪(北京君意公司)；PDGF、TGF-β1ELISA检测试剂盒(科顺生物公司)；兔抗β-actin、Axin抗体(ABclonal公司)，β-catenin、Cyclin D1 抗体(Proteintech公司)。

1.4分组、建模及干预 将大鼠随机分为正常组、模型组、阳和平喘颗粒低剂量组、阳和平喘颗粒中剂量组、阳和平喘颗粒高剂量组及桂龙咳喘宁组，每组8只。除正常组外，其他组大鼠按文献[7]方法制备COPD模型：在第1，14，21天气管内注入脂多糖(LPS)1 mg/kg，注入当日不烟熏；注入第2天将大鼠置于烟熏箱中，点燃20支大前门牌香烟，每次持续30 min，2次/d，连续12周。当大鼠出现肺实质破坏、管壁周围明显炎性细胞浸润、气道壁及气道平滑肌增厚表示COPD模型建立成功。平喘颗粒低、中、高剂量组分别给予阳和平喘颗粒1.75 g/(kg·d)、3.5 g/(kg·d)、7 g/(kg·d)灌胃，桂龙咳喘宁组给予桂龙咳喘宁3.5 mL/100 g灌胃，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，均1次/d，连续12周。

1.5检测指标及方法

1.5.1肺组织病理形态学 末次灌胃结束后，取大鼠右下肺组织，石蜡包埋切片，分别进行HE染色和Masson染色，光镜下观察肺组织病理改变。

1.5.2血清PDGF、TGF-β1水平 取腹主动脉血5 mL，3 000 r/min离心5 min，取血清，ELISA法检测血清中PDGF、TGF-β1水平，具体实验步骤参照说明书。

1.5.3肺组织中β-catenin、CyclinD1、Axin蛋白表达情况 采用Western blot法检测：将肺组织剪成小碎片，获取蛋白后每个加样孔加入10 μL相应蛋白，电泳、转膜，分别加 1∶100稀释的β-catenin抗体、CyclinD1抗体、Axin抗体，β-actin抗体4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，用Pierce-ECL试剂盒发光显影。β-catenin、CyclinD1、Axin与内参蛋白β-actin比值作为蛋白相对表达量。

1.5.4肺组织中wnt3a 、wnt5a、β-catenin、Axin、CyclinD1 mRNA表达情况 采用 RT-PCR法检测：取适量大鼠肺组织，称重并研磨成粉末，抽提RNA并反转录为cDNA，使用实时定量PCR试剂盒检测相应基因变化。wnt3a 上游引物为5’-TGCGACCTGTTGTGCTG-3’，下游引物为5’-AATGAACCCTGCTCCCTCT-3’；wnt5a上游引物为5’-TTCTTACCCAAACCGGACT-3’，下游引物为5’-CGCCATCTGCTTGACTTAC-3’；β-catenin上游引物为5’-TATGAGTGGGAGCAAGGC-3’，下游引物为5’-CTGCGTGGATGGGATCT-3’；Axin上游引物为5’-CTCTGGCTCTGGGAAAGTGG-3’，下游引物为5’-AAGCCCAGGGCAAAGTATCC-3’；CyclinD1 上游引物为5’-GCGTACCCTGACACCAAT-3’，下游引物5’-CTTCGCACTTCTGCTCCT-3’；内参β-actin上游引物为5’-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3’，下游引物5’-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3’。反应条件: 预变性95 ℃ 3 min,95 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，40个循环。用2-△△CT方法计算wnt3a 、wnt5a、β-catenin、Axin和CyclinD1 mRNA表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠肺组织病理学形态 HE及Masson染色显示，正常组大鼠肺泡结构正常，支气管腔光滑无明显增厚，少量炎性细胞浸润；模型组大鼠肺泡壁断裂，肺泡间隔增厚，炎性细胞浸润明显，气道壁、气道平滑肌厚度及气道上皮下胶原纤维沉积显著增加；桂龙咳喘宁组及阳和平喘颗粒各组大鼠肺泡结构破坏较模型组轻，气道壁、气道平滑肌厚度及气道上皮下胶原纤维沉积情况有所缓解，其中阳和平喘颗粒高剂量组改善更明显。见图1及图2。

图1 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织HE染色表现(×400)

图2 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织Masson染色表现(×400)

2.2各组大鼠血清PDGF、TGF-β1水平比较 模型组血清PDGF、TGF-β1水平均明显高于正常组(P均<0.05)；阳和平喘颗粒中、高剂量组和桂龙咳喘宁组血清PDGF、TGF-β1水平均明显低于模型组(P均<0.05)；阳和平喘颗粒高剂量组和桂龙咳喘宁组血清PDGF、TGF-β1水平均明显低于阳和平喘颗粒低剂量组(P均<0.05)，阳和平喘颗粒高剂量组和桂龙咳喘宁组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠血清PDGF、TGF-β1水平比较

2.3各组大鼠肺组织中β-catenin、CyclinD1和Axin蛋白表达情况 与正常组比较，模型组β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)，Axin蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。与模型组比较，阳和平喘颗粒低、中剂量组及桂龙咳喘宁组β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量降低不明显(P均>0.05)，阳和平喘颗粒高剂量组β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)；阳和平喘颗粒中、高剂量组和桂龙咳喘宁组Axin蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。阳和平喘颗粒各组β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量与桂龙咳喘宁组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，阳和平喘颗粒高剂量组Axin蛋白相对表达量明显高于桂龙咳喘宁组(P<0.05)。见图3及图4。

图3 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中β-catenin、CyclinD1和Axin蛋白表达情况

图4 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中β-catenin、CyclinD1和Axin蛋白相对表达量

2.4各组大鼠肺组织中wnt3a 、wnt5a、β-catenin 、Axin和CyclinD1mRNA表达情况 与正常组比较，模型组wnt3a、wnt5a、β-catenin、CyclinD1mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)，Axin mRNA相对表达量明显降低(P<0.05)。与模型组比较，阳和平喘颗粒低、中剂量组CyclinD1 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)，wnt3a、wnt5a、β-catenin、Axinm RNA相对表达量变化不明显(P均>0.05)；阳和平喘颗粒高剂量组wnt3a、wnt5a、β-catenin、CyclinD1 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)，Axin mRNA相对表达量明显升高(P<0.05)；桂龙咳喘宁组wnt3a、β-catenin、CyclinD1 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)，wnt5a、Axin mRNA相对表达量变化不明显(P均>0.05)；阳和平喘颗粒各组各指标与桂龙咳喘宁组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，阳和平喘颗粒高剂量组wnt3a、wnt5a、CyclinD1 mRNA相对表达量均明显低于阳和平喘颗粒低剂量组(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中wnt3a、wnt5a、β-catenin、Axin和CyclinD1 mRNA表达情况

3 讨 论

气道重塑、肺实质破坏是导致COPD气流受限的重要原因[1]。目前认为气道重塑是由慢性炎症反复刺激引起气道损伤和组织修复所致，主要病理特征为气道壁增厚、气道平滑肌细胞增生、气道上皮下胶原沉积、气道上皮细胞增生、鳞状细胞和杯状细胞化生等[8-9]。

TGF-β1、PDGF、Wnt/β-catenin信号通路均参与了COPD气道重塑过程。TGF-β1是一种主要作用于肺成纤维细胞的促纤维化因子，可促进细胞增殖，诱导细胞外基质沉积，使纤黏蛋白、胶原合成增多，细胞外基质过度沉积则使气道壁增厚，以上作用共同导致了气道重塑[10-11]。PDGF能够促进气道平滑肌细胞增殖，增加Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达[4，12]。wnt3a 、wnt5a是Wnt信号通路中调节Ⅱ型肺泡上皮细胞、平滑肌细胞增殖分化的关键配体[13-14]。β-catenin是判定Wnt通路是否激活的重要标记物，在细胞没有Wnt信号刺激时，β-catenin与支架蛋白Axin、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GSK3β形成毁灭复合体，磷酸化后被降解；当细胞有信号刺激时，Wnt配体与细胞膜上受体结合产生一系列反应后，抑制β-catenin、Axin等蛋白形成的毁灭复合体活性，使Axin降解，稳定的β-catenin入核后激活下游靶基因CyclinD1等转录[15]。研究表明，阻断Wnt/β-catenin信号通路，可明显减少TGF-β1诱导的细胞外基质沉积[5]，而激活此通路可促进PDGF诱导的气道上皮分化及气道平滑肌增厚[6]。本实验发现，模型组大鼠气道壁、气道平滑肌厚度及气道上皮下胶原沉积增加，血清TGF-β1、PDGF水平及肺组织中wnt3a、wnt5a、β-catenin、CyclinD1表达量明显升高，Axin表达量明显降低，说明Wnt/β-catenin信号通路激活可促进TGF-β1、PDGF表达，加剧COPD气道重塑。

中医认为COPD病程长且迁延难愈，乃久病“肺脾肾俱虚”引起肺的宣降、脾的运化、肾的气化功能失调，可致气血津液代谢失常，痰浊瘀血阻滞肺络。脏腑功能失调是气道重塑、气流受限的基础，故其治法当以调补肺肾、活血化痰为主[16-17]。阳和平喘颗粒具有补肾活血化痰作用，方中麻黄、白芥子、葶苈子、旋覆花、桔梗共同发挥宣肺平喘、祛痰化饮之效，加熟地黄、巴戟天、五味子增补肾温阳之功，可温煦脏腑、温化痰浊，佐以当归增活血化瘀功效。研究证实，具有补肾或活血化痰功效的中药能够减轻气道炎症，降低血清TGF-β1水平，通过MAPKs途径改善COPD气道重塑[18-19]。本课题组前期研究表明，阳和平喘颗粒能够减轻COPD患者临床症状，降低血清IL-6、IL-8、TNF-α水平[20-21]，并可提高COPD大鼠肺通气功能[17]。本实验发现，阳和平喘颗粒各组肺泡结构破坏减轻，气道壁、气道平滑肌厚度及气道上皮下胶原纤维沉积情况改善，阳和平喘颗粒高剂量组血清PDGF、TGF-β1水平及肺组织中β-catenin、CyclinD1、wnt3a、wnt5a表达量明显降低，Axin表达量明显升高。提示阳和平喘颗粒可抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而降低血清PDGF、TGF-β1水平，进而改善COPD大鼠气道重塑。

综上所述，阳和平喘颗粒调节Wnt/β-catenin信号通路，减少PDGF、TGF-β1表达可能是其改善COPD气道重塑的机制之一。本实验从现代医学的角度证实补肾活血化痰方可改善COPD气道重塑，为其临床应用提供了理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。