血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测在肝细胞肝癌中的临床价值

赖 蜜，胡 蝶，王晓玲，钟田雨

（赣南医学院第一附属医院检验科，江西 赣州 341000）

肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见恶性肿瘤之一，也是第三大癌症死亡原因［1］。HCC的高致死率与HCC的高恶性程度和发病隐匿有关，大部分患者确诊时已为晚期，错过了最佳治疗时机。目前，HCC的诊断依赖于血清学检查、影像学检查和病理学检查，但都无法对早期HCC进行诊断。甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是一种针对肝癌的肿瘤标记物，临床上被广泛用于肝癌的辅助诊断和术后复发的监测［2］。但是AFP的检测也被证明缺乏灵敏性和特异性，多达40%的HCC患者血清AFP处于正常水平，尤其多见于早期HCC患者［3］。然而在一些慢性乙型肝炎和肝硬化患者上又见显著升高［4-5］。肝脏作为人体重要的代谢器官，组织代谢组学方法是研究肝癌代谢异常的重要手段。甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合形成的一种结合型胆酸，甘胆酸作为肝脏代谢产物，其水平可以动态反映肝脏损伤过程。相比较谷丙转氨酶、谷草转氨酶等常规肝功能检测指标，甘胆酸更敏感且能对早期肝炎、肝硬化进行疗效评估和早期诊断［6］。一项百人的队列研究表明，HCC患者血清甘胆酸水平显著高于健康人群［7］。因此，甘胆酸在监测和诊断HCC方面具有潜在价值。

据估计，全球约有47%肝细胞癌病例发生在中国，其中＞70%的HCC患者为乙肝相关性HCC［8-9］。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）DNA的变异被认为是HCC的危险因素。由于HBV逆转录酶缺乏校对功能，HBV DNA容易出现突变，且突变率是其他DNA病毒的10倍［10-11］。其中与HCC相关的BCP区（Basal core promoter，BCP）和前C区（Precore，C）的突变最为常见。HBV BCP区主要突变包括A1762T/G1764A。研究表明，这种双突变可提高HBV的复制率［12］。多项队列研究表明，BCP双突变与HCC进展具有紧密相关性［13-14］。伴随BCP区双突变的乙肝携带者在术后也更容易发生转移［15］。HBV前C区常见G1896A突变，其突变也与HBV的复制程度相关［16］。前C区突变多见于慢性乙肝患者，其突变造成终止密码子形成，影响HBeAg的表达并引起HBV免疫逃逸［17］。这对疾病判断和疾病干预带来严峻挑战。因此，准确判断HBV是否突变及突变类型对肝癌诊断、治疗和预后具有重要意义。

目前，已有大量关于单独甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变在HCC诊断中的意义的研究。但很少有关于三者潜在联系在HCC诊断的报道。本研究收集了200例肝癌患者，包括100例乙肝肝癌患者和100例非乙肝肝癌患者。通过对血清甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变的联合检测，探讨甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变在HCC之间的关联，以及三者联合检测在HCC临床诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2020年12月—2022年2月在本院就诊的HCC患者血清200例，其中100例肝细胞癌患者经化学发光法检测HBV病毒表面抗原阳性（HBsAg≥0.05 IU·mL-1），100例肝细胞癌患者HBV病毒表面抗原阴性（HBsAg＜0.05 IU·mL-1）。将200例患者分为乙肝肝癌组和非乙肝肝癌组。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：HCC患者均经影像学和病理学诊断明确，符合《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》［18］。患者及其家属对此次研究内容知情并签署知情同意书。

排除标准：（1）患者合并其他恶性肿瘤；（2）患者有严重凝血功能障碍。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 仪器 迈瑞BS-820M生化仪、罗氏Elecsys e602全自动电化学发光仪，ABI2720PCR扩增仪。

1.3.2 试剂 甘胆酸试剂盒购于美康生物科技有限公司，AFP试剂盒购于罗氏制药有限公司，乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测试剂购于达安基因有限公司。

1.4 检测方法

1.4.1 血清甘胆酸的检测 取入组患者外周血3～5 mL，收集于含分离胶的真空采血管中。接收样本后，放入离心机1 600 g离心10 min及时分离血清用于后续项目检测或-70 ℃保存待检。使用迈瑞BS-820M生化仪，在质控标准下按照说明书进行操作。检测方法为胶乳增强免疫比浊法，检测线性范围为0.5～80 mg·L-1。

1.4.2 血清AFP的检测 收集入组患者血清，使用罗氏Elecsys e602全自动电化学发光仪，在质控标准下按照说明书进行操作。检测方法为电化学发光法，检测范围0.5～1 000 ng·mL-1。

1.4.3 乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测 按照说明书操作取入组患者血浆，加入引物在ABI2720中进行PCR扩增，按比例（HBV preC/BCP突变PCR反应液42 μL/人份+HBV preC/BCP突变酶系3 μL/人份）取相应量的PCR反应液及酶系，充分混匀后按45 μL/管分装至0.2 mL离心管中，然后分别取处理后样品、阳阴性质控品5 μL，加入到0.2 mL离心管中，6 000 rpm 瞬时（3 s）离心，将各反应管放入PCR仪。50 ℃→3 min；93 ℃→5 min；（93 ℃ 30 s→54 ℃ 45 s→72 ℃ 30 s）×45 个循环，最后72 ℃保温7 min后再进行杂交显色。杂交显色具体步骤如下：杂交液Ⅰ与杂交液Ⅱ预热至42 ℃，备用；杂交液Ⅰ（完全浸没膜条），备用；将PCR产物加入对应的杂交显色液离心管中，使得膜条在杂交过程中低速转动（100～150 转·min-1），杂交45 min；放入水浴水槽（42 ℃），100转·min-1，水浴5 min，弃杂交液Ⅱ。加入20 mL结合液，放置于20～30 ℃脱色摇床上摇摆（30～50 转·min-1），避光反应10 min。弃结合液，弃杂交液Ⅰ。再将50 mL离心管倒置于吸水纸上，吸干管底液体。加入相应量的显色液，避光反应5～10 min；当显色弱时，可适当延长显色时间。显色反应结束后，立即弃显色液，加入20 mL溶液Ⅱ，脱色摇床上摇摆2 min。弃溶液Ⅱ，加入20 mL去离子水，轻摇2～3 min取出。用吸水纸吸去膜条表面水分，尽快在扫描仪上扫描膜条［若不能立即进行扫描，请冻存于（-20±5） ℃］。参照达安膜条斑点识别分析系统操作说明书的要求，使用扫描仪扫描膜条，设定相应的参数并输出扫描结果，然后进行数据分析HBV前C区ntA1896（nt1896G-A）、ntA1899（nt1899G-A）突变，BCP区nt1762/A1764（nt1762AT、nt1764G-A）联合突变情况。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 22.0统计软件进行处理。计数资料以n（%）表示，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 乙肝肝癌组共100例患者，化学发光法检测血清HBsAg均为阳性（HBsAg≥0.05 IU·mL-1），其中男性90例，女性10例，平均年龄（55.00±10.72）岁。非乙肝肝癌组100例患者，化学发光法检测血清HBsAg均为阴性（HBsAg＜0.05 IU·mL-1），其中男性69例，女性31例，平均年龄（61.94±11.76）岁。

2.2 乙肝肝癌组和非乙肝肝癌组血清甘胆酸、AFP及HBV突变类型比较 非乙肝肝癌组与乙肝肝癌组的血清甘胆酸水平差异无统计学意义，乙肝肝癌组血清AFP水平显著高于非乙肝肝癌组（表1）。

乙肝肝癌组BCP区突变率为14%，前C区突变率为23%，其中部分病例存在BCP区和前C区的混合突变，突变率为10%。非乙肝肝癌组也可见1例前C区突变（见表1）和1例HBV DNA突变野生型，这是由于检测方法的局限性造成乙肝突变患者的漏检。

表1 两组患者血清甘胆酸、AFP比较

2.3 HCC患者HBV突变类型与血清甘胆酸、AFP的关系 为了探究HCC患者HBV前C区/BCP区基因突变与血清甘胆酸、AFP之间的潜在关系，我们对100例HBV阳性的HCC患者血清甘胆酸、AFP进行了分类比较。结果表明，HCC患者基因突变组血清AFP显著高于无基因突变组，差异有统计学意义（P=0.003 5），而血清甘胆酸在HCC患者基因突变组与无基因突变组的差异无统计学意义（P=0.528 5）（表2）。为了探究是哪一种突变造成血清AFP水平的改变，分别对BCP区突变和前C区突变分类统计，结果表明，AFP的差异仅在BCP区1762/1764位点有统计学意义（P=0.031 5），在前C区1896/1899位点差异无统计学意义（P=0.092 2）（表2）。

表2 HBV突变类型与血清甘胆酸、AFP的关系

3 讨 论

慢性乙肝病毒感染是个全球卫生问题，如果治疗不及时，将从肝炎进展到肝硬化甚至肝癌。研究发现，HBsAg阳性者的肝癌发生风险是HBsAg阴性者的12倍［19］。对HCC患者做到准确判断、及时治疗和有效监测是HCC治疗的一大难点和重点。

甘胆酸被广泛用于肝性疾病的诊断，血清甘胆酸水平的变化反映出肝损伤的动态过程，因此，甘胆酸在HCC诊断中具有潜在价值。遗憾的是，在本研究中，尚未发现甘胆酸在诊断HCC类型和HBV突变之间的相关性。AFP是一种对肝癌敏感的肿瘤标志物，在临床上被广泛用于肝癌的诊断及术后的检测，但AFP的升高不只见于肝癌患者。我们的结果表明，AFP与HCC类型具有潜在相关性，乙肝HCC患者AFP水平显著高于非乙肝HCC患者。在对乙肝HCC患者突变类型进行深入研究，我们发现，前C区突变比例明显高于BCP区突变比例。2012年一项关于西南地区HBV DNA突变的研究表示，在500多份HBV血清标志物阳性的血清中，BCP区突变率和前C区突变率分别为34.1%和39.7%，同期，河北正定县前C区突变为18.1%［20］。本研究样本的BCP区突变和前C区突变比例均低于西南地区水平，这不仅可能与地域、突变检测试剂盒的敏感性相关，还可能与HBV基因型有关，不同突变类型的比例在不同HBV类型中也有不同。其次，本研究发现HBV突变的HCC患者血清AFP水平更高，这种差异在BCP区突变组中有统计学意义。BCP区在结构上与HBVx基因有部分重叠，其A/T的突变使得HBVx基因结构更为稳定，这也是突变携带者更易恶化和HCC患者转移的重要因素。值得注意的是，BCP区突变可以增强HBV复制，高水平的血清AFP也反映出肿瘤细胞处于活跃期，两种检测手段是否可以联合应用于HCC的早期诊断还需要后续实验。其次，HBsAg是目前临床上被用来判断HBV感染的重要标志物，也是WHO公认的关键指标［21］。免疫学方法是目前临床常用HBsAg筛查的检测方法，具有高灵敏和高特异性。然而HBV基因的突变会影响HBsAg的表达或改变其抗原性，造成一定的漏检风险。一项研究发现，中国隐匿性乙肝患者HBsAg的亲水区突变率高达55.7%［22］。本研究数据表明，HBsAg阴性的乙肝携带者比例有2%之高。其次，HBV BCP区/前C区作为HBV的高突变区，对HCC进展具有密切关系，因此，临床上是否有必要加强对HBV突变类型的检测值得深入探究。