沙丁胺醇治疗重度哮喘急性发作疗效及对患儿血清TOLL样受体4、核转录因子κB通路的影响

马立茵,李 静

(1.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121012；2.朝阳市第二医院,辽宁 朝阳 122099)

支气管哮喘(Bronchial asthma,BA)是由多种细胞(T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、气道上皮细胞)、细胞因子及各类活性炎症介质协同作用导致的一类慢性炎症性疾病，具有高应答性、慢性气道炎症及不可逆性损害等特点[1-2]。其主要临床症状表现为反复发作性喘息、咳嗽，对患儿的生理、生长发育及心理健康均造成了严重的损害。当儿童哮喘急性发作，极易造成严重的低氧血症和二氧化碳潴留，病情严重者甚至会发展为呼吸衰竭，对患儿的生命安全造成严重威胁。再加上儿童的中枢神经系统尚未发育成熟，因哮喘发作导致的缺氧、二氧化碳潴留还可能会影响患儿的智力和认知能力[3-4]。既往研究表明血清TOLL样受体4(Toll-like receptors 4，TLR4)的表达与气道炎症的发生发展过程存在密切的联系，研究指出TLR4与气道炎症呈正相关，其水平高低可直接反映支气管哮喘患者的炎症严重程度[5-7]。核转录因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信号通路主要与机体的自身免疫能力相关，可维持正常的机体生理功能，在调控细胞凋亡、细胞周期及分化等方面起着重要的作用。NF-κB信号通路的自身免疫在脊椎动物中主要表现为炎症反应，长期的信号通路异常会对机体的性能产生不利的影响。因此基于以上两类信号通路上对哮喘患者进行病情评估、疗效监测具有现实意义。目前临床上关于小儿支气管哮喘的治疗依旧以雾化吸入糖皮质激素、β2受体激动剂等药物来控制炎症、缓解哮喘症状为主[8]。硫酸镁(MgSO4)是目前应用较广的一类哮喘治疗辅助药物，在成人患者的应用治疗中疗效较好，可显著改善哮喘加重导致的早期临床症状，减少患者再入院概率[9]。沙丁胺醇是一类选择性β2受体激动剂，具有较强的支气管扩张作用，还可增强气道黏液纤毛清除功能，抑制过敏介质释放，有效缓解气道痉挛症状。目前关于沙丁胺醇应用于儿童哮喘已有研究报道，但基于TLR4/NF-κB通路分析其疗效价值仍无相关研究。因此，本文基于TLR4/NF-κB通路探讨沙丁胺醇治疗儿童重度哮喘急性发作的临床疗效，旨在为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年6月至2020年8月于我院治疗72例重度哮喘急性发作儿童作为研究对象，按照随机数字表法分为研究组和对照组，每组36例。另选取同期于我院行健康体检的儿童36例作为正常组。其中，研究组年龄1～5岁，体重15～31 kg；对照组年龄1～5岁；体重15～30 kg；正常组年龄1～5岁，体重16～30 kg。三组患者的性别、年龄、体重、身高等一般资料比较差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性，见表1。该研究通过我院伦理委员会的批准。病例纳入标准：研究组和对照组入组患儿均符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[10]中的相关诊断标准；存在哮喘症状急性发作、心率明显增加、呼气高峰流量(Peak expiratory flow，PEF)低于期望值的80%以及存在哮鸣音等任一临床表征者；临床资料完整，且依从性良好；不存在研究中所使用的药物的相关过敏史；患儿及其法定代理人均充分知情同意，且自愿签署知情同意书，愿意配合后续随访；病情为重度哮喘急性发作，无需急救措施。排除标准：存在心、肝及肾功能异常者；排除合并恶性肿瘤、严重器官功能衰竭者；排除存在心理障碍及精神障碍者；合并感冒、支气管炎等其他原因引发咳嗽症状者；近3个月内存在糖皮质激素、抗体拮抗剂类药物治疗史者。

表1 三组患儿一般资料比较

1.2 干预方法 排除诱因、全身应用糖皮质激素、氧疗及必要时采取机械通气治疗的基础上，两组患儿均采用面罩式一次性使用氧气雾化吸入器(WK101-001 Ⅰ型，江苏伟康洁婧医疗器械)治疗,雾化液体积为3 ml，雾化治疗时间为20 min。对照组患儿仅给予硫酸镁注射液治疗，将151 mg硫酸镁注射液(国药准字H12020994)溶于0.9%氯化钠溶液中制备成浓度为33%的硫酸镁雾化液，体积3 ml。研究组给予沙丁胺醇联合硫酸镁进行治疗，将2.5 mg沙丁胺醇(国药准字H31022999)与151 mg硫酸镁充分溶于0.9%氯化钠溶液液中制成3 ml雾化液，两组均治疗3个月。正常儿童不做任何药物处理，仅在3个月治疗期内完善治疗前后的相关检查。

1.3 观察指标

1.3.1 临床疗效评价：参照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》中哮喘急性发作治疗评价标准制定本研究疗效评价标准。显效，FEV1或PEF指标数值高于预期值的60%；有效，FEV1或PEF指标数值处于预期值40%～60%之间；无效，FEV1或PEF指标数值低于预期值的40%。记录两组患儿肺内哮鸣音、咳嗽、气促等临床症状体征消失时间及哮喘复发时间。

1.3.2 肺功能监测：应用哮喘电子检测仪(NK360)分别检测三组治疗前后的肺功能相关指标，包括第1秒用力呼气量(Forced expiratory volume in the first second，FEV1)、PEF、用力肺活量(Forced vital capacity，FVC)、用力呼出50%肺活量时的瞬间呼气流量(Forced expiratory flow at 50% of FVC，FEF50%)，计算FEV1/FVC值。

1.3.3 血清炎症因子检测：三组均于治疗前后在空腹状态下采集肘静脉血，经抗凝、离心处理后，保留血清并冻存于-80 ℃环境中，待统一检测。应用酶联免疫吸附法检测血清中白细胞介素-4(Interleukin-6，IL-4)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)水平。试剂盒均由美国R&D公司生产，所有操作均严格按照说明书的标准执行，控制批内差异<10%，批间差异<15%。

1.3.4 TLR4、NF-κB mRNA检测：应用Q-PCR法检测外周血单核细胞TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达水平，结合文献并参照美国Invitrogen 公司提供的mRNA序列，通过Primer 5软件设计并分析引物,mRNA检测步骤RT反应严格参照说明书执行操作。采用相对表达量分析法进行数据分析，指标为2-△△Ct。

1.3.5 不良反应：观察治疗期间两组患儿不良反应发生情况。

2 结 果

2.1 两组患儿临床疗效比较 研究组治疗有效率为94.44%显著高于对照组66.67%(χ2=8.867，P<0.05)。研究组气促、咳嗽、肺内哮鸣音消失时间均明显短于对照组，研究组哮喘复发时间明显长于对照组(均P<0.05)。见表2、3。

表2 两组患儿临床疗效比较[例(%)]

2.2 三组患儿肺功能比较 治疗前，研究组和对照组患儿FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%肺功能指标水平均明显低于正常组(均P<0.05)；治疗后，研究组和对照组患儿FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%指标水平均显著提升(均P<0.05)，其中研究组肺功能改善情况明显优于对照组(均P<0.05)。见表4。

表3 两组患儿症状体征消失时间和哮喘复发时间比较

表4 三组患儿肺功能指标比较

2.3 三组患儿血清炎症因子水平比较 治疗前，研究组和对照组患儿IL-1β、IL-4及TNF-α等炎症因子水平均高于正常组，IFN-γ水平低于正常组(均P<0.05)；治疗后，研究组和对照组患儿IL-1β、IL-4及TNF-α表达水平均显著下降，IFN-γ水平明显提升(均P<0.05)，其中研究组IL-1β、IL-4及TNF-α水平降幅明显大于对照组，IFN-γ水平增幅大于对照组(均P<0.05)。见表5。

表5 三组患儿血清炎症因子水平比较(ng/L)

2.4 三组患儿TLR4、NF-κB信号通路相关基因变化比较 治疗前，研究组和对照组患儿TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表达水平均高于正常组(均P<0.05)；治疗后，研究组和对照组患儿TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表达水平均显著下降(均P<0.05)，其中研究组TLR4 mRNA水平高于对照组，NF-κB mRNA基因表达水平低于对照组(P<0.05)。见表6。

表6 三组患儿TLR4、NF-κB信号通路相关基因变化比较

2.5 两组患儿不良反应发生情况比较 两组患儿在治疗期间均未出现严重的不良反应，停药后均得到明显缓解，研究组不良反应总发生率为19.44%高于对照组11.11%，但组间比较差异无统计学意义(χ2=0.966，P>0.05)，见表7。

表7 两组患儿不良反应发生情况比较[例(%)]

3 讨 论

随着社会的迅猛发展，人们的生活水平和生活环境也发生了极大的变化，儿童哮喘的诱因也在不断发生变化。我国哮喘流行病学调查显示，我国城市儿童哮喘患病率在近20年间显著增长，从1990年的0.11%～2.03%到2010年的0.42%～5.73%，发病率几近翻番，分析数据不难发现，多数患儿及其家长对哮喘的危险因素认知不足，致使患儿用药不规范、未进行系统化规范化的治疗等现象较为普遍[11-12]。支气管哮喘急性发作是儿科临床的常见急症，其中重度急性发作通常表现为心率显著增加和三凹征、奇脉、满肺哮鸣音，情节严重者甚至会出现低氧血症及意识障碍，甚至可能危及生命。

硫酸镁是一类临床常用的解痉药物，对平滑肌具有良好的扩张作用，且安全性较好，可用作哮喘治疗的辅助药物。相关报道显示，硫酸镁雾化治疗应用于成人哮喘患者的疗效显著，可有效改善其因哮喘加重引发的早期临床表现，减少其住院治疗的几率。针对吸入支气管扩张剂没有良好反应的急性重症哮喘成人或儿童，采用硫酸镁静脉滴注治疗有效且其安全性较高。但关于硫酸镁雾化应用于哮喘患者治疗的研究结论尚未完全统一说法[13]。短效β受体激动剂(Short acting beta agonists，SABA)是用于缓解哮喘急性发作的常用药，其临床疗效确切且应用较广，但对于中-重度哮喘急性发作的患儿的症状控制效果并不理想。沙丁胺醇是一种选择性的β2受体激动剂，对支气管有着较强的扩张作用，可兴奋气道平滑肌和肥大细胞膜表面的β受体，舒张气道平滑肌，抑制肥大细胞和嗜碱细胞脱粒颗粒和过敏介质的释放、降低微血管通透性、增强气道上皮纤毛摆动等来有效缓解气道高反应[14]。

目前临床有大量研究证实硫酸镁与沙丁胺醇联用对儿童支气管哮喘急性发作的治疗效果十分显著。本研究结果显示，在治疗前，硫酸镁联合沙丁胺醇吸入治疗的研究组患儿和单纯硫酸镁治疗的对照组患儿的肺功能指标、炎症因子水平、TLR4 mRNA及NF-κB mRA基因表达情况均与正常组有统计学差异，表明以上指标的选择均具有较好的临床意义。其中研究组治疗有效率为94.44%显著高于对照组66.67%；研究组气促、咳嗽、肺内哮鸣音消失时间均明显短于对照组，研究组哮喘复发时间明显长于对照组。两组患儿肺功能均得到明显改善，但联合治疗的临床获益更佳，研究组FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%指标水平均明显高于对照组。进一步比较两组炎症因子水平发现研究组患儿的IL-1β、IL-4及TNF-α水平降幅明显大于对照组，IFN-γ水平增幅大于对照组。提示硫酸镁联合沙丁胺醇雾化吸入治疗可有效抑制哮喘儿童急性发作期炎症因子的释放，有效抑制气道的过敏反应，进而改善其临床症状和呼吸功能，有效降低其复发率。分析认为长期反复应用β2受体激动剂进行治疗会导致支气管细胞膜上β受体对激动的敏感性降低，再加上急性重度发作哮喘儿童自身β2受体功能较差，对腺苷酸环化酶的激活不足，进而导致细胞cMAP浓度偏低。而硫酸镁中的镁离子可激活肾上腺能β受体功能，增强β受体与激动剂之间的亲和力，且可对β2受体起到一定的调节作用，从而增强β受体激动剂的支气管扩张效果。硫酸镁对腺苷酸环化酶有着激活作用，使得三磷酸腺苷生成环磷酸腺苷，进而提高cAMP/cGMP的比值，抑制肥大细胞介质的释放，同时可活化蛋白酶系统、降低细胞内钙离子水平，促使气管内平滑肌松弛，降低气道阻力，有效解除气管痉挛，改善肺循环功能，消除支气管黏膜水肿，保障气道通畅，发挥扩张支气管的作用[15-16]。两者作用机制不同，联用能够产生协同作用提高疗效。此外，两组患儿在治疗期间均未出现严重的不良反应，停药后均得到明显缓解，研究组不良反应总发生率为19.44%高于对照组11.11%，但组间比较差异无统计学意义，表明沙丁胺醇不会增加不良反应，安全性较高。翁蔚琪等[17]研究证明，硫酸镁联合硫酸沙丁胺醇雾化吸入治疗小儿中-重度支气管哮喘发作的疗效较好，可显著改善患儿肺功能，缩短住院时间，降低ICU留治率，与本研究结论基本一致。

NF-κB信号通路与机体的自身免疫相关，此通路可维持正常的机体功能。TLR4细胞内的TOLL/IL-1受体结构域可与MyD88的羧基端相互结合，结合体与IL-1受体相关激酶(IL-1 receptor associatedkinase，IRAK)的氨基端再度结合，激活IRAK。被激活后的IRAK再激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF Receptor-associated factors 6，TRAF-6)，活化后的TRAF-6进而激活NF-κB抑制物的激酶(Inhibitor of NF-κB kinases，IKKs)复合物。金平飞等[18]研究指出，IKKs复合物可促进NF-κB抑制物磷酸化和降解，进而促进NF-κB的有效激活，继而诱导特定基因转入细胞核内并表达，诱导炎性细胞因子的表达。研究显示，TLR/NF-κB信号通路若长期处于活化的状态下，则会持续引发严重反应，最终导致肺部功能出现病理性改变[19-20]。姚雪红[21]以60例住院患儿为研究对象，随机分为治疗组和对照组各30例,另设30例健康儿童作为正常组。治疗组采用咳喘平颗粒治疗,对照组采用孟鲁司特钠颗粒治疗,结果显示，相关治疗药物可通过抑制IRAK磷酸化,来对TLR4/NF-κB信号通路进行调控，使其处于活化状态,改善气道炎性反应,从而改善喘息性支气管炎(寒性哮喘)患儿的临床症状。本研究中显示，治疗后，研究组和对照组患儿TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表达水平均显著下降，且研究组NF-κB mRNA显著低于对照组。提示沙丁胺醇可显著降低IL-1受体相关激酶的水平，TLR4可结合的受体浓度降低，对IRAK的激活能力降低，进而使得患儿血清内的TRAF-6因子水平降低，使得后续一系列链化反应无法继续发生，进而显著下调NF-κB mRNA、TLR4 mRNA表达水平。这与本研究组患儿的IL-1β、IL-4及TNF-α水平显著低于对照组结论相互照应。

综上所述，沙丁胺醇雾化吸入治疗可有效改善重度哮喘急性发作儿童的临床症状，延长其哮喘复发时间，显著改善患儿的肺功能，降低血清炎性因子表达水平，减轻炎症损伤，降低TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表达水平，且安全性较好。本研究为单中心、小样本研究，所得结论存在一定的局限性，有待扩大化的多中心试验证实。