基于数据挖掘和网络药理学探讨中医药治疗乳腺癌的用药规律及作用机制

谢婷 李杰 胡金辉 杨争

〔摘要〕 目的 探討中医药防治乳腺癌的用药规律及作用机制。方法 以《肿瘤良方大全》 《肿瘤方剂大辞典》 《中医肿瘤学》 《乳腺癌与乳腺增生》 《药典临床用药中药成方制剂》文献为数据来源，运用中医传承辅助平台（V2.5）挖掘中药治疗乳腺癌的用药规律及核心处方，并利用网络药理学方法分析其核心处方的潜在作用机制。结果 最终纳入297首中药方剂，挖掘出10组核心药物配伍及5首新处方，高频药物有茯苓、黄芪、柴胡、白术、甘草、白芍、夏枯草、当归、郁金、白花蛇舌草等，药物归经以肝经和脾经为主，性味以甘温居多，以“柴胡-郁金-夏枯草-炒枳壳-橘核”为首的核心处方主要通过调控Rap1、Hippo、MAPK、Toll样受体等信号通路抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，发挥抗肿瘤作用。结论 乳腺癌的中医药治疗以调节肝脾为主，辨其标本虚实，重用甘温以补虚，解毒散结以治标。其核心处方通过多通路、多成分、多靶点来调控乳腺癌的发生发展。

〔关键词〕 乳腺癌;数据挖掘;中医传承辅助平台;网络药理学;用药规律;作用机制

〔中图分类号〕R273       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.027

〔Abstract〕 Objective To explore the drug rule and potential mechanism of Chinese medicine in the prevention and treatment of breast cancer （BC）. Methods The literature of Tumor Prescriptions， Tumor Prescriptions Dictionary， Traditional Chinese Medicine Oncology， Breast Cancer and Breast Hyperplasia and Prescription Preparation of Traditional Chinese Medicine for Clinical Use in Pharmacopoeia were used as data sources， the traditional Chinese medicine inheritance assistance platform （V2.5） was used to explore the medication rules and core prescriptions of traditional Chinese medicine in BC treatment， and the potential mechanism of the core prescriptions was analyzed by network pharmacology method. Results A total of 297 prescriptions were screened out， involving 10 core drug combinations and 5 new prescriptions. The high frequency drugs included Fuling （Poria）， Huangqi （Astragali Radix）， Chaihu （Bupleuri Radix）， Baizhu （Atractylodis Macrocephalae Rhizoma）， Gancao （Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma）， Baishao （Paeoniae Radix Alba）， Xiakucao （Prunellae Spica）， Danggui （Angelicae Sinensis Radix）， Yujin （Curcumae Radix）， Baihuasheshecao （Hedyotis Diffusa）， etc. The main channels of drugs were liver meridian and spleen meridian， and their drug property and taste were sweet and warm. The core prescriptions led by "Chaihu （Bupleuri Radix）-Yujin （Curcumae Radix）-Xiakucao （Prunellae Spica）-Chaozhiqiao （Aurantii Fructus）-Juhe （Citri Reticulatae Semen）" mainly inhibit the proliferation， invasion and migration of tumor cells by regulating Rap1， Hippo， MAPK， Toll-like receptor and other signaling pathways， thus playing an anti-tumor role. Conclusion The treatment of BC with traditional Chinese medicine is mainly based on regulating liver and kidney， distinguishing the deficiency and excess of the root cause and symptoms， using sweet and warm to to supplement the deficiency， detoxifying and dispersing the knot to treat symptoms. Its core prescription regulates the occurrence and development of BC through multi-pathway， multi-component and multi-target.

〔Keywords〕 breast cancer; data mining; traditional Chinese medicine inheritance assistance platform; network pharmacology; medication rule; mechanism of action

乳腺癌（breast cancer， BC）是发生在乳腺导管上皮或乳腺小叶的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤[1]，发病率占女性恶性肿瘤的第1位[2]，近十几年来，我国BC的发病率呈逐年上升的趋势，每年约有三十余万女性被诊断BC[3]。BC的西医治疗手段主要有手术治疗、放化疗、内分泌治疗、靶向生物治疗，随着这些治疗方法的规范，BC的病死率在逐步下降[4]。西医对症治疗BC虽然降低了患者病死率，但治疗结束后常存在复发与转移，且治疗过程中存在一系列的不良反应，患者常难以耐受，严重影响患者的生活质量及治疗的依从性。研究显示，中医药治疗在疾病的癌前期预防、急性期的增效减毒、慢性期的巩固维持上发挥重要的作用，它可以改善患者的体质，提高患者的生活质量，对患者手术、放化疗具有增效减毒的效果，可预防肿瘤的复发转移，有效延长患者的生存周期[5]。

1 资料与方法

1.1  资料来源

检索《肿瘤良方大全》《肿瘤方剂大辞典》《中医肿瘤学》《乳腺癌与乳腺增生》《药典临床用药中药成方制剂》[6-10]治疗BC的方剂。

1.2  纳入标准[11]

（1）主治、功效明确，用于治疗BC的中药方剂;（2）方剂组成完整，有明确的药物组成，用量信息明确;（3）方剂用法为内服。

1.3  排除标准[11]

（1）组成重复的方剂;（2）方剂组成不完整（有方无药、缺少用量信息、药物组成不明确等）;（3）方剂中有不明确的药物者;（4）食疗方。

1.4  中药名称规范化处理

中药名称参照全国中医药行业高等教育“十三五”规划教材《中药学》[12]和《中华人民共和国药典》（2020年版）[13]对方剂中出现的中药名称进行规范化处理;同一种药物不同部位视为不同中药，如莲子和莲子心，视作2种药;同一种药物的不同炮制品，功效差异较大者，统计时按不同药物进行统计。

1.5  数据库的建立与数据分析

1.5.1  数据库的建立  将符合标准的方剂进行中药名称规范后，录入“中医传承辅助平台（V2.5）”中的方剂管理模块，建立数据库，采取一人录入，双人审核的制度，对录入的数据进行逐个核对，以确保数据挖掘的准确性。

1.5.2  数据分析  采用频次统计、关联规则、熵聚类算法等数据挖掘方法，通过“中医传承辅助平台（V2.5）”，对药物的使用频次、性味、归经及组方规律进行聚类分析，得到潜在的核心药物组合，并在此基础上挖掘出新处方。

1.6  基于网络药理学分析核心新处方治疗BC的作用机制

1.6.1  核心药物活性成分筛选及靶点预测  （1）利用TCMSP[14]数据库，以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%、药物类药性（drug-like properties， DL）≥0.18为条件[15]，筛选核心新处方药物中较高活性的化合物;（2）通过PubChem[16]数据库收集各有效成分的SDF结构式;（3）通过SwissTargetPrediction[17]数据库，将有效成分导入数据库，获取核心处方药物的潜在靶点。

1.6.2  疾病靶点库建立  利用GeneCards[18]数据库，以“breast cancer”作为关键词进行检索，获得数据库中信度较高（score≥30）的BC疾病相关靶点，建立疾病靶点数据库。

1.6.3  共同靶点筛选及蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）網络构建  将上述获得的药物靶点与疾病靶点进行相互映射，运用Cytoscape（3.7.2）软件构建“核心药物-有效成分-BC疾病”靶点网络，进行可视化分析。将“药物-疾病”共同靶点导入STRING[19]数据库，获取靶点PPI信息并导入Cytoscape（3.7.2）软件，绘制网络。

1.6.4  GO及KEGG通路富集分析  应用WebGestalt[20]数据库对PPI网络中涉及的关键基因进行GO分析和KEGG通路富集分析，筛选出差异显著的生物过程（biological process， BP）、细胞组分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）及KEGG通路，并对结果进行可视化呈现。

2 结果

2.1  用药频次统计

共有297首方剂符合筛选条件，涉及382味中药，用药频次≥35的中药有26味，见表1。排在前10位的分别是：茯苓、黄芪、柴胡、白术、甘草、白芍、夏枯草、当归、郁金、白花蛇舌草。其中，茯苓使用频次最高，在297首处方中，出现97次。

2.2  药物性味归经分析

对治疗BC的382味药物的性味归经进行统计分析，见表2。在四气中，药物以温性药物为主，为1931次，占40.49%，其次为平性药（1530次）和寒性药（1099次），分别占32.08%和23.04%;在五味中，以甘味药物最多，为3188次，占42.86%，其次为苦味药（2014次）和辛味药（1650次），分别占27.08%和22.18%;在归经中，药物主要入肝、脾、肺经，占比分别为16.55%、14.45%、13.53%。

2.3  组方规律分析

2.3.1  基于关联规则的组方规律分析  基于关联规则对药物的常用组合进行频数统计，根据对不同参数提取数据结果的预读，当设置支持度个数为40，设置置信度为0.9时，频次>40次的药物组合有共有25对，主要集中在茯苓、黄芪、柴胡、白術、甘草、白芍、夏枯草、当归、郁金等药物之间，见表3。在分析药物组合的关联规则时，设置置信度>0.930，得到15条关联规则。见表4。

2.3.2  基于“熵聚类”组方规律分析  根据收集的处方数量，基于复杂系统熵层次聚类方法，通过对不同参数提取数据结果的预读，设置惩罚度为2，设置相关度为6，进行聚类分析，得到潜在的核心药物组合，见表5。按照相关度与惩罚度约束，在核心药物组合的基础上，演化出5首潜在新方，见表6。将新方采用网络化展示，见图1。

2.4  基于网络药理学的作用机制研究

2.4.1  药物活性成分  在获得的核心药物组合及新方组合中，柴胡、郁金、夏枯草、炒枳壳4味药在用药频次统计中出现频次最高，因此，将此4味药作为核心药物配伍进行网络药理学探讨。通过TCMSP共收集柴胡-郁金-夏枯草-炒枳壳配伍组化合物648个，其中柴胡349个、郁金222个、夏枯草60个、炒枳壳17个。筛选出符合条件的活性化合物35个，其中柴胡17个、郁金15个、夏枯草11个、炒枳壳5个，将其作为候选化合物，结果见表7。

2.4.2  药物作用靶点  剔除无化学结构及无靶点化合物（MOL004598、MOL004609、MOL004628、MOL004702、MOL004718、MOL006772、MOL004241、

MOL004260、MOL004263、MOL004309、MOL004316），得到配伍组候选化合物共1997个靶点，其中柴胡706个、郁金344个、夏枯草701个、炒枳壳246个。通过GeneCards数据库，以“breast cancer”为关键词，提取数据库中信度较高（score≥30）的相关基因靶点，收集并筛选到BC靶点357个基因靶点。取交集后获得配伍组候选化合物与BC的共同靶点共57个，韦恩图见图2。

2.4.3  “药物-疾病”共同靶点PPI网络  共同靶点PPI网络见图3。根据Degree值设定节点大小。Degree值越大，节点越大。该网络图中共有57个靶点，包含57个节点、717条边，表明配伍组可能通过多个靶点在防治BC中发挥作用。

2.4.4  GO和KEGG富集分析  共富集320个BP，结合FDR、ratio与P值结果权重分析，并绘制火山图（图4A），主要富集于促进细胞运动、上皮细胞增殖、抑制有丝分裂细胞周期、肽基丝氨酸修饰、DNA结合转录因子活性与胶原代谢过程的调节等。

共富集3个CC，结合FDR、ratio与P值结果权重分析，并绘制火山图（图4B），主要富集于膜区、受体复合物、转移酶复合物、转移含磷基团等。

共富集43个MF，结合FDR、ratio与P值结果权重分析，并绘制火山图（图4C），主要富集于蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇二磷酸激酶活性、磷酸酶结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白C端结合、辅因子跨膜转运蛋白活性等。

KEGG共富集94个信号通路，结合FDR、ratio与P值结果权重分析，并绘制火山图（图4D），主要富集于Rap1信号通路、Hippo信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路等。

3 讨论

中医学里虽无“BC”这一病名，但根据其临床症状，可将BC归属于“乳岩”“乳石痈”等范畴，《说文解字》中亦提到，“癌”是由“岩”字化生而来。中医学对BC这一疾病的认识始于晋·葛洪《肘后备急方》[11]，至明清时期才建立起较成熟的理论体系。总结历代的中医文献，医家多认为正气亏虚是BC发病的内在基础，肝气郁滞、阳气亏虚、痰瘀毒聚是BC的主要病因病机，总的治疗原则为扶正祛邪，再依具体情况采用疏肝解郁、清热解毒、活血化瘀、化痰散结等治法。

3.1  用药规律及思路探讨

《素问遗篇·刺法论》言：“正气存内，邪不可干”，中医学认为正气亏虚是BC发病的内在基础，情志内伤是BC发病的重要因素，肝气郁滞贯穿该疾病的发生发展过程。正气虚损，肝失疏泄，气机失常，脾肾亏虚，先后天失养，内生痰浊、血瘀蕴结成毒于乳房，日久形成乳岩。《金匮要略·卷上·藏府经络先后病脉证一》言：“上工治未病……见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。张锡纯在《医学衷中参西录》中指出“欲治肝者，原当升脾降胃，培养中宫”。本研究中，归经统计分析表明，排名前6位依次为肝、脾、肺、胃、心、肾经。高频使用的药物有茯苓、黄芪、柴胡、白术、甘草、白芍、当归、郁金等，柴胡、白芍、郁金疏肝行气，茯苓、黄芪、白术益气健脾，当归活血养血。肝藏血而主疏泄，肝气条达则气血流通，心情舒畅。脾主血主运化为气血生化之源，脾气健运，可化生气血养五脏。脾的运化有赖于肝的疏泄，脾气健旺则生血有源，肝血充足，则肝有所藏，肝得所养，则能正常疏泄。二者相辅相成，使人体阴阳并调，乳络通畅。

3.2  作用机制研究

中医药可通过多成分、多途径、多靶点整体调节的方式治疗BC，具有副作用小、机体耐受好等优势[21]。本研究基于中医传承辅助平台对收集到的中医药治疗BC的方剂进行分析，获得10组核心药物组合及5首新方组合。在5首新处方中，新方3橘核、炒枳壳、夏枯草、柴胡、郁金5味药物组合配伍在用药频次统计中出现的频次最高，且该核心药物组整体以疏肝解郁为主，肝郁是BC病变的基础，肝气郁结贯穿BC发生发展的整个病程，故选取该配伍组来探索其治疗BC的作用机制。在筛选橘核的有效化学成分时，因不满足“口服生物利用度（OB）≥30%、药物类药性（DL）≥0.18”[14]这一条件被剔除，因此，将柴胡、郁金、夏枯草、炒枳壳4味中药作为研究对象进行网络药理学作用机制的探讨。柴胡性味苦、辛，具有免疫调节、抗抑郁、抗肿瘤等药理作用[22]，柴胡皂苷D是柴胡的主要活性成分，对多种肿瘤细胞具有广泛的抑制作用，其主要通过阻滞肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，诱导肿瘤细胞凋亡等多种途径发挥抗肿瘤作用[23]。郁金性味辛、苦、寒，其有效成分δ-榄香烯不仅能够针对多种癌症标志物发挥抗肿瘤作用，还能通过多种机制起到抑制肿瘤转移、提高机体免疫力等作用[24]。夏枯草性味苦、辛、寒，其抗肿瘤主要活性成分三萜类化合物能减少肿瘤组织内血管生成，可通过雌激素受体、细胞特异性周期蛋白、表皮生长因子受体等靶点及相关通路抑制肿瘤细胞转移[25-26]。炒枳壳性味苦、辛、酸，其成分川陈皮素对多种肿瘤细胞有抑制其增殖、迁移和侵袭的作用[27]，并且能增强抗癌药物抗肿瘤效果[28]。

对于此4味药物作为中药配伍组共同使用的作用机制尚不明确，因此，本研究继续运用网络药理学手段，通过KEGG通路富集分析，得知该4味药物作为核心药物组合治疗BC可能主要通过Rap1信号通路、Hippo信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路等。肿瘤的發生是一个多基因参与、多步骤发生的过程。现代研究发现，BC的发生与患者体内信号通路的异常密切相关，调控信号通路是控制肿瘤发生发展的重要作用基础[29]。Hippo信号通路是一条由一系列蛋白激酶和转录因子组成的激酶链[30]，它直接或间接调控肿瘤转移和侵袭相关靶基因的表达，促进肿瘤的侵袭和转移[31]。在许多类型的肿瘤中，Hippo通路往往失调，并与肿瘤的恶性进展密切相关，被认为是恶性肿瘤的潜在治疗靶点[32]。MAPK是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶，它通过亚族中激酶的活化或失活调节细胞内的生物反应，参与调控细胞的增殖、凋亡、自噬、炎症反应等相关基因及蛋白的表达[33]。Toll样受体是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，是先天免疫系统的重要组成部分，它与炎症级联反应密切相关，可营造炎症微环境促进肿瘤形成[34]，参与肿瘤的不同发展阶段[35]。Rap1属于Ras家族的小分子量GTPase，包括Rap1a、Rap1b两种亚型，它可通过多种信号转导途径被激活，在恶性表型的许多方面发挥重要作用[36-37]。因此，该4味药物治疗BC可能是通过调控Rap1信号通路、Hippo信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路等共同发挥作用。

4 结论

本研究基于中医传承辅助平台（V2.5），对《肿瘤良方大全》《肿瘤方剂大辞典》《中医肿瘤学》等文献中的方剂进行探索、分析，初步归纳总结中医药治疗BC的遣方用药规律，对BC病-方-药之间的内在联系进行了有益探索，基于核心处方运用网络药理学分析处方可能的作用机制。BC的中医药治疗应从肝脾肾三脏调节，辨其标本虚实，重用甘温以补虚，解毒散结以治标。其核心处方对BC的作用机制主要通过调控多通路、多成分、多靶点来实现。但因处方数量及数据分析软件的局限性，研究难免有失偏颇，对于研究结果仍需配合进一步的临床实践以及药效验证，以期为中医药治疗BC提供依据和方法。

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