脓肿分枝杆菌临床分离株药物敏感性初探

岳陈达 岑蕊言 杨伟江 王利群 罗杰夫 黎 敏 鲁卫平 雷 霞

1陆军军医大学大坪医院(陆军特色医学中心)皮肤科，重庆，400042；2陆军军医大学大坪医院(陆军特色医学中心)检验科，重庆，400042

脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus, MAB)属于非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteriaum, NTM)中的快速生长分枝杆菌群(rapid-growing mycobacteriaum，RGM)，可侵犯人体的肺、皮肤软组织、骨关节、淋巴结等组织器官造成局部或播散性的感染，是造成我国皮肤NTM病最常见的RGM[1，2]。皮肤脓肿分枝杆菌感染的皮损常表现为在手术或受伤部位形成的柔软、波动、局限的皮下脓肿或结节[3]，特别是一些美容注射后的感染病变，常为皮下多发脓肿结节，部分甚至形成难以愈合的溃疡和窦道。MAB仅对极少数抗生素敏感，对一线抗结核药物如异烟肼、利福平均天然耐药，临床上治疗十分困难。美国胸科协会和美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐针对RGM感染时需先用阿米卡星、头孢西丁、环丙沙星、克拉霉素、米诺环素、美罗培南、利奈唑胺、莫西沙星等进行药敏实验后根据结果再进行相关临床用药[4，5]。根据国内外指南，当前皮肤脓肿分枝杆菌感染的治疗仍参照肺部感染的治疗方案，除单纯单个皮肤软组织病变可仅口服抗生素治疗外，其余感染均需要静脉注射药物和口服药物联合治疗，并分初始和维持两个阶段进行：初始阶段静脉应用阿米卡星和替加环素联合口服大环内酯类药物，至少4周；维持阶段口服大环内酯类药物并根据药物敏感性实验联合使用下列1～3种药物：氯法齐明、利奈唑胺、米诺环素、莫西沙星、复方新诺明，至少6个月。总之，当前对于皮肤脓肿分枝杆菌感染的治疗需要多药物联合长时间治疗[6-9]。

为了解皮肤和软组织感染中脓肿分枝杆菌的药物敏感性和耐药现状，本研究检测了脓肿分枝杆菌临床分离株以及标准菌株对国内外指南中推荐的药物及一线抗结核药的药物敏感性，以期在临床治疗皮肤软组织脓肿分枝杆菌感染方面提供一定的实验依据。

1 资料与方法

1.1 菌株、试剂及材料

1.1.1 菌株 脓肿分枝杆菌标准株ATCC 19977购自北纳生物菌种保藏中心，临床菌株分离自2019年9月至2021年6月就诊于陆军军医大学大坪医院皮肤科的脓肿分枝杆菌皮肤软组织感染患者，在本次研究中收集的11例脓肿分枝杆菌感染的病人均为青壮年女性，且都有感染部位的皮肤软组织侵入性操作史，其中5例为埋线减肥、1例为针灸、6例为“精华”、“蛋白”注射。取患者脓液标本进行细菌培养后分别采用高效液相色谱法和微阵列芯片法进行菌种鉴定，两种鉴定方法均确定为脓肿分枝杆菌后保存菌株，编号为MAB01-11用于后续实验。

1.1.2 材料及试剂 Middlebrook 7H9肉汤培养基基础，CAMHB肉汤培养基基础，刃天青钠，克拉霉素、阿奇霉素、阿米卡星、盐酸莫西沙星、盐酸环丙沙星、盐酸米诺环素、美罗培南、利奈唑胺、异烟肼、利福平、头孢西丁、头孢美唑标准品(北京索莱宝)。PBS缓冲液、二甲基亚砜(DMSO)、吐温80(Tween-80)、甘油(上海生工)。

1.2 主要试剂配制 7H9肉汤培养基：用450 mL双蒸水溶解2.35 g Middlebrook7H9肉汤培养基基础，加入1 mL甘油及0.25 g Tween-80，充分搅拌使培养基完全溶解后分装。121℃灭菌10 min，置于4℃冰箱保存。

CAMHB肉汤培养基：用1000 mL双蒸水溶解22.0 g CAMHB肉汤培养基基础，加入0.5 g Tween-80，充分搅拌使培养基完全溶解后分装。121℃灭菌10 min，置于4℃冰箱保存。

抗生素配制：先将抗生素粉末制成10 mg/mL的贮存液过滤后置于-20℃冰箱保存，其中克拉霉素、阿奇霉素、利福平、头孢西丁、头孢美唑用DMSO溶解，阿米卡星、盐酸莫西沙星、盐酸环丙沙星、盐酸米诺环素、美罗培南、利奈唑胺、异烟肼用双蒸水溶解。每次使用前将储存液用菌悬液稀释为1280 μg/mL的工作液。

刃天青配制：先将刃天青钠粉末溶于双蒸水制成1 mg/mL的储存液，置于4℃冰箱保存。使用时将储存液用CAMHB肉汤培养基稀释至0.2%的工作液备用。

1.3 菌液制备及接种 挑取受试菌接种于7H9肉汤培养基中，于35℃、150 r/min摇床中培养至对数生长期，OD600为0.8左右；8000 r/min，5 min离心后用含有0.05% Tween-80的PBS洗去死菌及代谢产物，反复2～3次。用生理盐水将麦氏浊度调至0.5备用。Tween-80用于减少脓肿分枝杆菌聚集的趋势。

1.4 微量肉汤稀释法测定MIC 参照CLSI系列文件和相关文献并稍作修改，用CAMHB肉汤培养基调至浓度约为5×105cfu/mL，加入96孔细胞培养板中、第1列每孔180 μL，第2～11列每孔100 μL，最后1列为无菌对照，在第1列每孔加入20 μL抗生素工作液，混匀后取100 μL至第二列、而后逐级稀释至第11列，此时每一行抗生素浓度均128～0.0625 μg/mL。将培养板用封板膜密封，锡箔纸包裹后放入37℃恒温培养箱中培养。60 h后每孔加入过滤除菌的刃天青工作液，继续孵育12 h后记录颜色结果[10-12]。

2 结果

培养结束后取出96孔板，若阳性对照孔中细菌生长良好(粉红色)且空白对照孔中未见细菌生长(蓝色)，则可以进行读数，MIC定义为使刃天青保持蓝色的最低抗生素浓度(图1)。 MIC数值见表1，实际MIC应位于最后一个蓝色孔和第一个红色孔所对应的数值之间。

表1 12株脓肿分枝杆菌对12种抗生素的MIC值(μg/mL)

图1 刃天青测脓肿分枝杆菌对12种抗生素的MIC

克拉霉素对MAB的MIC为0.125～0.5 μg/mL，阿奇霉素对MAB的MIC为0.5～16 μg/mL，阿米卡星对MAB的MIC为2～4 μg/mL，米诺环素对MAB的MIC为32～128 μg/mL，莫西沙星对MAB的MIC为4～8 μg/mL，环丙沙星对MAB的MIC为4～16 μg/mL，美罗培南对MAB的MIC为32～64 μg/mL，利奈唑胺对MAB的MIC为4～32 μg/mL，头孢西丁对MAB的MIC为32 μg/mL，头孢美唑对MAB的MIC为16～32 μg/mL，异烟肼和利福平对MAB的MIC均>128 μg/mL。

根据CLSI指南，比对指南中RGM对各种抗生素的折点(表2)，将各菌株的耐药情况进行判定，具体见表3，菌株实际的MIC应为最后一个蓝色孔和第一个红色孔所对应的数值之间。由于部分抗生素(阿奇霉素、头孢美唑)指南中并未规定折点，故参照该同类的有折点的抗生素(克拉霉素、头孢西丁)进行判读；针对抗结核药(异烟肼、利福平)则参照慢生长分枝杆菌的折点进行判读。

表2 CLSI中推荐各抗生素的折点

表3 12株脓肿分枝杆菌对12种抗生素的敏感性情况

结果显示，MAB对克拉霉素、阿米卡星、利奈唑胺、头孢西丁均敏感，对异烟肼、利福平、米诺环素、环丙沙星、美罗培南均耐药，对莫西沙星除1例为中度敏感外均耐药。

3 讨论

虽然NTM相关感染在我国并不强制报道，但我们仍可以发现皮肤NTM感染的发病率和患病率在国内外快速上升[13-15]。皮肤MAB感染常发生于外伤[16]、手术、美容注射[17]、针灸、纹身[18]等侵入性操作之后，大都与医源性侵入操作相关。由于MAB对含氯消毒剂、酒精、戊二醛等常用医用消毒剂有较强的抵抗力，其在医疗美容机构内的爆发也并不少见[19-21]。在本次研究中收集的11例脓肿分枝杆菌感染的病人全部都有皮肤软组织的侵入性操作史，如埋线减肥、针灸、蚕丝蛋白注射等。结合国内外文献和我们科之前的诊疗经验，大部分皮肤软组织侵入性操作后发生的经久不愈感染均应高度怀疑非结核分枝杆菌感染，特别是脓肿分枝杆菌感染，在经验用药时应尽量避免采用异烟肼、利福平等天然耐药的药物[22]。

表2的结果说明，皮肤感染的MAB仅对于克拉霉素、阿米卡星、利奈唑胺和头孢西丁敏感，对于异烟肼、利福平、米诺环素、美罗培南、环丙沙星均耐药，对于莫西沙星，除1株MAB中度敏感外其余菌株同样耐药。由于部分抗生素如阿奇霉素、头孢美唑指南中没有推荐的折点，我们参照其同类的其他抗生素进行比对，根据表1的结果我们可以发现，克拉霉素相比于阿奇霉素对脓肿分枝杆菌的MIC更低，而头孢美唑对于脓肿分枝杆菌的MIC则与头孢西丁相当。

此外，在本次实验中，我们加入了MAB的标准菌株ATCC19977，该细菌是由肺部MAB感染的样本中分离，该菌株表现出了与皮肤感染的MAB不完全相同的耐药特性：皮肤感染的MAB对于大环内酯类药物克拉霉素、阿奇霉素和噻唑烷酮类药物利奈唑胺更加敏感，而对于喹诺酮类药物环丙沙星、莫西沙星则更加耐药，而对阿米卡星、头孢西丁、头孢美唑则基本相当。Guo[23]、陈振华等[24]针对临床中肺部感染的MAB的耐药性研究结果同样显示肺部感染的MAB有相当比例对喹诺酮类、四环素类以及碳青霉烯类药物仍较为敏感,表明皮肤和肺部感染的MAB的耐药性可能存在一定差异，尤其是喹诺酮类和碳青霉烯类药物当前在皮肤MAB感染的治疗中作为一线药物被广泛使用，值得我们进一步研究及探讨。Jeong[25]和Philips[22]等对于皮肤及肺外脓肿分枝杆菌感染的研究中也可以观察到类似结果，皮肤分离的脓肿分枝杆菌对于喹诺酮类药物以及四环素类药物的耐药性均较高。然而在当前的临床实践中，喹诺酮类、四环素类药物以及碳青霉烯类药物被作为一线药物广泛使用，值得我们进一步研究及探讨。目前并没有文献或研究发现肺部感染与皮肤感染脓肿分枝杆菌存在遗传上的差异，故二者不同的体外药敏结果可能与脓肿分枝杆菌的生物学特性相关。脓肿分枝杆菌是一种专性需氧菌，在低氧条件下(比如皮肤脓肿内)可转入休眠状态，在与外界较低的物质交换水平下保持分裂，此时细菌对于抗生素的摄取下降，可能导致耐药性上升[26]。脓肿分枝杆菌还存在一种诱导耐药机制，这种机制可使脓肿分枝杆菌在长期与大环内酯类药物共同作用后对其产生耐药，并通过一系列复杂机制使细菌的外排泵活性发生变化，肺部感染脓肿分枝杆菌的病人多有基础疾病史且长期使用多种抗生素，这可能诱导脓肿分枝杆菌对不同抗生素的外排发生变化[27]。皮肤感染的患者大多为外源性感染，一次性感染细菌的载量较大，细菌可在皮肤软组织内形成休眠体、生物膜、索状结构等复杂的生物结构，从而表现出不同的耐药性。此外，当然，作为一种典型的胞内寄生菌，MAB感染是细菌与人体相互作用的复杂过程，虽然体外药敏实验可以提供较为客观量化的细菌耐药情况，但不同抗生素在体内发挥作用的机制不同，临床用药的效果可能与体外药敏的结果并不完全平行。

总的来说，由于脓肿分枝杆菌特殊的细菌结构以及特殊的耐药机制，导致其对于临床上常用的抗生素均存在不同程度的耐药，这导致了皮肤脓肿分枝杆菌治疗充满困难，包括有限的药物选择、治疗周期长、易反复和极易产生耐药。相比于肺部感染MAB的患者，皮肤MAB感染患者大多为身体健康、无基础疾病的青壮年；如前所述，皮肤的结构、感染MAB的方式也与肺部感染有较大差异。因此，皮肤MAB感染的治疗是否需要参考甚至照搬肺部感染的方案，仍需大量研究去探索和验证。