基于功能化介孔硅纳米材料的miRNA超灵敏检测

李晶晶，吴 丹，欧阳津，那 娜

（北京师范大学 放射性药物重点实验室，化学学院，北京 100875）

随着纳米技术的发展，其在生物检测、临床诊断中逐渐展示出巨大的应用前景。通过对纳米材料进行合理的设计和合成，可将目前临床上的诊断和治疗两个分离的过程或功能汇集于同一纳米材料中，构成诊疗一体化纳米平台［1-4］。利用该平台，可以实时、精确诊断病情并进行同步治疗，还可在治疗过程中，监控疗效并随时调整给药方案，得到最佳治疗效果，减少毒副作用［5-7］。这类纳米材料由于具有良好的可修饰性和负载活性（或功能）物种的能力，非常有利于构筑纳米诊疗一体化平台，在精准医学领域具有巨大的应用价值［8-11］。其中，介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）凭借其可控的介孔结构、高的比表面积、良好的生物相容性和易化学修饰的优点［12-13］，被认为是制备零提前释放、靶向释放和时空可控释放药物的最有前途的候选药物。到目前为止，已经开发了大量基于MSN 的纳米药物系统，这些系统基于纳米材料的合成，结合超分子组装、聚合物多层膜包覆进行构建，并可以利用DNA 和蛋白质作为药物释放“守门人”。进入细胞内或体内后，基于氧化还原反应、pH 值或温度的变化、酶催化、竞争性结合或光辐射等作用，刺激触发药物释放［3，14-15］，发挥治疗作用。虽然这些释放系统设计良好，但由于肿瘤细胞与周围正常组织在温度、pH值、化学成分、酶浓度等方面的差异不明显，使得其在体外和体内的实际应用仍有很长的路要走［16-18］。因此，构建对特定的内源性刺激响应的有效药物释放系统，特别是对肿瘤组织中异常表达的生物分子的响应，仍然是人们关注的研究热点之一。

核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）是遗传信息与蛋白质之间的桥梁。经研究，目前多种RNA 分子都可以作为肿瘤标志物用于癌症的早期诊断。作为RNA分子的一种，microRNA（miRNA）已经成为一种新型的癌症特异性生物标志物。miRNA是较小（约22 bp）的高度保守非编码RNA，在不同的细胞类型中进行内源性表达，可通过碱基互补配对的方式使基因沉默，从而起到基因表达关键调控因子的作用。与正常组织相比，肿瘤细胞表现出特异的miRNA表达谱，因而miRNA可以作为新的生物标志物指示不同的癌症［13，19-20］，为潜在的靶点治疗提供新的可能性［21-22］。其中，基于扩增反应使纳米材料在细胞内完成高效扩增，从而放大细胞内极低浓度RNA的响应信号，是肿瘤标志物高灵敏检测的有效途径之一。

本研究合成了一种基于适配体的发夹DNA 包封介孔二氧化硅纳米材料，进行癌症诊疗试剂递送。二氧化硅纳米材料的高比表面积及吸附性，使之可有效负载扩增检测试剂及癌症治疗药物，集miRNA扩增检测及可控药物释放于一体进行疾病诊疗研究。该工作扩充了基于纳米材料的疾病诊疗研究，为硅基纳米材料的应用发展提供了数据支持。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

正硅酸乙酯（TEOS，Aldrich chemistry），十六烷基三甲基氯化铵（CTAC，国药集团化学试剂有限公司），三乙醇胺（TEA，98%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，98%）（Alfa Aesar），水杨醛（99%，分子量122.12，山东西亚化学工业有限公司），氯化镁（分析纯，分子量95.21，北京化学试剂公司）；阿霉素（Dox）、HG1（序列：5'-TCAGACTGATGTTCGTAGCTTATCAACA/iCy3dT/CAGTCTGATAAGCTATTTTT TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'）、HG2（序 列：5' -TTCGTAGCTTATCAGACTGA/iCy5dT/GTTGATAAGCTACGAACATCAGTTTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'）、miRNA-21（序列：5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3'）、TBE 缓冲剂（1×，17.05 g）均为上海生工生物工程股份有限公司产品。PBS缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 7.2 ～7.4，Solarbio），琼脂糖（Agarose B，BBI Life Sciences），4sgreen Plus 染色剂（BBI Life Sciences）。电泳所需试剂（25 ～500 bp DNA Marker、6×DNA Loading Buffer，宝生物工程大连有限公司），Tris 溶液：28 mmol/L Tris-HCl（含200 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2，pH 7.4），乙醇（分析纯，分子量46.07，天津市致远化学试剂有限公司）。

实验所用去离子水均由Milli-Q纯水系统处理（18.0 MΩ·cm）。

1.2 仪器

FEI Talos F200S 透射式扫描电子显微镜（赛默飞世尔科技）、RF-6000 荧光光谱仪（岛津公司）、SX2-2.5-10 箱式电阻炉（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、ChampGel5000 凝胶成像分析仪（北京赛智创业科技有限公司）、Mini-PROTEAN ® Electrophoresis Systems 凝胶电泳仪（美国Bio-Rad 公司）、BS124S 电子天平（北京塞多利斯仪器系统公司）、CRY-2102C 恒温振荡器（上海市百典仪器）、Zetasizer Nano ZS90 动态光散射（马尔文帕纳科有限公司）、DZF-6020 真空干燥箱（北京中科博达仪器科技有限公司）、TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、大龙实验室手动单道可调式移液器（量程0 ～10 μL，20 ～200 μL，100 ～1 000 μL）、DF-101Z 集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州特尔仪器设备有限公司）、Q-G1000/C6干式恒温器（北京六一生物科技有限公司）、MTC-100恒温混匀仪（杭州米殴仪器有限公司）、KQ-50DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 介孔硅纳米颗粒合成

在40 mL 去离子水中加入4 g CTAC 和0.16 g TEA 搅拌混合，升温至95 ℃，并于95 ℃加热1 h 后，加入1.5 mL TEOS，继续搅拌混合1 h［23］。离心收集MSNs，用水、乙醇多次洗涤，真空干燥。550 ℃空气煅烧5 h除去残余的有机物CTAC，于乙醇中重分散，置于4 ℃冰箱储存备用。

1.4 介孔硅纳米颗粒表面氨基化

取20 mg的MSNs 分散于40 mL 乙醇中，超声处理。加入40 μL APTES，室温搅拌反应3 h。分别用乙醇和去离子水洗涤3 次，除去多余的反应物，加入500 μL 的Tris 缓冲液，混合均匀，于4 ℃储存备用。

取少量洗涤后的介孔二氧化硅于离心管中，10 000 r/min 离心去除上清液，乙醇洗涤2 次，10 000 r/min 离心，留少量固体于管底。加入10 μL 水杨醛溶液，离心管底部沉淀变黄，证明介孔二氧化硅纳米颗粒氨基化成功。

1.5 介孔硅纳米颗粒载药

取10 μL 氨基化介孔硅纳米颗粒分散在含Dox 的PBS 溶液（2 mL，0.5 mg/mL）中，在黑暗条件下室温搅拌24 h后，离心收集负载Dox的纳米颗粒（Dox@MSNs）。用PBS溶液洗涤除去表面吸附的Dox残留物，加入252 μL PBS缓冲液，混合均匀，待用。

1.6 介孔硅纳米颗粒修饰DNA

将DNA 链在28 mmol/L Tris-HCl 溶液中于95 ℃加热5 min，缓慢退火至室温，使链完美形成DNA二级结构（含HG1 和HG2）。将84 μL 10 μmol/L 探针HG1 和84 μL 10 μmol/L 探针HG2 溶液与252 μL 载药介孔硅纳米颗粒于室温涡旋搅拌30 min制备DNA纳米复合物。混合物以15 000 r/min离心10 min，用PBS缓冲液多次洗涤以去除过量的DNA 探针。加入1 mL PBS缓冲液混合均匀，得到核酸-硅基纳米复合物（Dox@MSNs-DNA）。

2 结果与讨论

2.1 硅纳米复合材料的设计

本研究中硅纳米复合材料的合成思路是：首先，在介孔二氧化硅纳米颗粒的孔隙内部载入肿瘤药物Dox；同时，发夹G-四链体DNA（HG1、HG2（分别用荧光基团Cy3 和Cy5 标记））可在中性pH 值下通过静电吸附作用，灵活吸附在APTES 修饰的单分散二氧化硅表面，对癌症标志物miRNA 进行特异性响应。如图1 所示，在没有刺激的情况下，Cy3 和Cy5 荧光团与猝灭剂的距离很远，不会发生荧光共振能量转移（FRET），荧光信号很弱。同时，无目标识别响应触发纳米载体的孔隙解锁，药物传递系统处于锁定状态。纳米载体在靶标miRNA-21刺激响应下，会启动与HG1的杂交，解开HG1的发夹结构以产生单链尾，增加HG1在颗粒表面的移动性，促进其与HG2杂交。HG2与HG1杂交，引发发夹组装，产生双链G-四链体，形成更稳定、更刚性的杂化物，刚性双链构象对纳米组装体的亲和力降低，因此从表面解离。解离产物中的HG1、HG2分别修饰的荧光染料Cy3、Cy5 由于距离拉近激活了Föster 共振能量转移（FRET）信号，使得荧光信号放大，进一步指示靶标miRNA-21的表达。与此同时，靶标miRNA-21的释放可成为下一次发夹组装的引发物，并不断循环扩增，以实现对肿瘤内痕量靶标miRNA-21的灵敏检测。值得提出的是，该类硅基纳米材料具有良好的生物安全性，其进入体内完成使命后会水解，水解产物的主要成分为硅酸，可通过尿液排出体外，因而在生物活体检测中具有很大优势。

图1 Dox@MSNs-DNA纳米材料用于miRNA-21响应的药物控释示意图Fig.1 Schematic diagram of Dox@MSNs-DNA nanoparticals for controlled drug release in response to miRNA-21

2.2 硅纳米复合材料的合成与表征

MSNs的透射电子显微镜（TEM）结果如图2A、B所示。由图可见，所得到的MSNs大小相似且均匀，平均直径约为55 nm，有明显介孔存在。同时，动态光散射（DLS）表征也进一步验证了单分散MSNs 的大小（图2C）。用Zeta 电位分析了DNA 修饰的MSNs的组装过程。中间产物MSNs-NH2纳米配合物具有正的ζ电位（图2D），作为生物门的核酸吸附在MSNs-NH2上后，核酸修饰的MSNs（MSNs-DNA）显示出5.6 mV 的ζ电位，相比MSNs-NH2降低。这种降低是由于在修饰过程中，MSNs-NH2吸附的核酸上有大量的负磷酸基团。DLS也进一步验证了DNA修饰的MSNs成功组装。

图2 MSNs的TEM图像（A、B），及MSNs、MSNs-NH2、MSNs-DNA的DLS（C）与Zeta电势（D）Fig.2 TEM images of MSNs（A，B），DLS data（C）and Zeta potentials（D）of MSNs，MSNs-NH2 and MSNs-DNA

2.3 琼脂糖凝胶电泳

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了miRNA-21 触发释放的机制（图3）。未加入靶标miRNA-21 时，HG1与HG2的杂交产物较少，添加5 nmol/L 靶标后，观察到较慢的迁移速率，这是由于miRNA-21与DNA 杂交形成了22 个碱基对。表明在靶标的参与下，HG1、HG2 能更有效地进行发夹组装，实现对miRNA-21的高效循环扩增。

图3 琼脂糖凝胶电泳图像Fig.3 Agarose gel electrophoresis images

2.4 体外FRET效应

基于FRET的设计以及荧光供体和受体的激活，循环扩增的纳米传感器策略在体外检测miRNA-21靶标时表现出特殊的荧光响应。如图4 所示，随着靶标miRNA-21 浓度的增高，HG1 链上修饰的Cy3染料于566 nm 处的荧光逐渐减弱，而HG2 链上修饰的Cy5 染料于668 nm 处的荧光逐渐增强，表明Cy3供体和Cy5受体之间存在有效的能量共振转移，体现了该方法对细胞内miRNA荧光激活成像的可行性。在0 ～30 nmol/L miRNA-21 浓度范围内，Cy5、Cy3 分别在668 nm 和566 nm 处的荧光响应比值（y）与miRNA-21 浓度的对数（x）呈线性关系，线性方程为y=0.064 4x+0.087，r2=0.989 1，检出限（S/N=3）为0.04 nmol/L，与DNA杂交的动力学一致［24］。

图4 不同浓度miRNA-21检测的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of miRNA-21 detected at different concentrations

2.5 靶标特异性验证

由于高渗透长滞留效应（EPR）的存在，使得纳米材料在进入细胞时更容易滞留在肿瘤部位。为进一步提高肿瘤靶向性，本研究在纳米材料上修饰靶向肿瘤的适配体，以使纳米材料有更好的靶向效果。为了评估该循环扩增的纳米传感器的选择性，考察了在反应体系中不加入靶标、加入靶标miRNA-21、加入非靶标miRNA-29、miRNA-155、miRNA-199 及靶标单碱基错配和三碱基错配后的荧光强度，结果如图5A 所示。添加各种分析物后，Cy5 与Cy3 的荧光强度之比如图5B 所示。由图可见，加入靶标miRNA-21 后显示出较强的荧光共振转移，Cy5 染料的峰明显增强，而加入其他非靶标物质，Cy5 与Cy3 的荧光强度之比较低，表明该荧光策略对靶标miRNA-21的检测具有良好的特异性。

图5 Dox@MSNs-DNA对不同靶标的响应荧光光谱图（A）及柱状对比图（B）Fig.5 Fluorescence spectra of Dox@MSNs-DNA sensor for different targets（A）and histogram comparison（B）

2.6 Dox@MSNs－ DNA的药物释放

考察了Dox@MSNs-DNA 作为体外药物控释系统的能力。向1 mL Dox@MSNs-DNA 复合材料体系中加入5 μL的1 μmol/L 靶标miRNA-21溶液，使miRNA-21的终浓度为5 nmol/L。以荧光光谱仪检测实时释放行为（图6A）。发现在480 nm激发波长下，药物Dox于596 nm处发射出荧光，荧光强度与时间的关系如图6B 所示。可观察到未加入靶标的前两小时上清液中Dox 的荧光强度几乎不变，加入靶标后，荧光逐渐增强，表明药物被逐渐释放。实验现象表明，随着靶标与介孔硅纳米外层封装DNA的不断杂交，封装的药物可进行有效地控制释放。一段时间后，药物释放的荧光减弱，可能是从介孔中释放的药物进入了杂交DNA 的四链体部位，从而使得上清液中检测到的Dox 的浓度下降。结果表明，miRNA在孔打开和诱导药物可控释放中起关键作用。

图6 Dox@MSNs-DNA在不同时间释药的荧光光谱（A）及随时间的释药曲线（B）Fig.6 Fluorescence spectra of Dox@MSNs-DNA at different drug release times（A）and drug release curve over time（B）

3 结 论

本研究设计并制备了一种新型的单分散Dox@MSNs-DNA，用于肿瘤标志物的高灵敏检测及其触发的药物按需释放。该载药系统以介孔二氧化硅纳米颗粒为生物活性分子的载体，在介孔中装载药物的同时对材料表面进行DNA 功能化。在肿瘤标记物miRNA-21 的刺激下，两条链上的荧光团由于距离的拉近激活FRET 信号，产生荧光信号放大，从而实现了对miRNA-21的超灵敏荧光激活成像。材料表面功能化的DNA 作为防止Dox 释放的DNA 门，使该药物传递系统具有更准确的释放性能。此外，基于对材料的改性和修饰，该硅基纳米材料还可以对其他药物进行输送和生物靶向可控释放，为随需应变给药系统的发展开辟了新的前景，在癌症治疗方面具有巨大的潜力。