基于SSR标记的胡麻粗脂肪及脂肪酸组分的关联分析

高凤云 斯钦巴特尔 周 宇 贾霄云 苏少锋 赵小庆 金晓蕾

（内蒙古自治区农牧业科学院特色作物研究所/内蒙古自治区农牧业科学院生物技术研究所，010031，内蒙古呼和浩特）

胡麻（Linum usitatissimum L.）是特色油料作物，在我国主要分布于内蒙古、甘肃、新疆、宁夏、河北和山西等地区[1-2]。胡麻籽富含不饱和脂肪酸（亚麻酸、亚油酸、油酸）、木酚素和亚麻胶等多种营养物质，具有降血脂、降血压、降血糖以及预防心脑血管疾病等多种保健功效[3-5]。

胡麻油脂含量的评价对胡麻品质遗传改良具有重要意义。赵利等[6]对 116份胡麻种质资源的油脂和碘价含量进行检测分析，初步筛选出一批高亚麻酸的优良种质。伊六喜等[7]对 401份胡麻种质进行表型评价，筛选出亚麻酸含量55%以上的品种16份。张琼等[8]以 162份胡麻重组自交系为研究材料，对粗脂肪和5种脂肪酸含量进行遗传分析，结果表明，油脂含量存在广泛变异，表现出超亲分离现象。以上研究对胡麻油脂含量的评价具有一定意义，但表型数据易受环境影响，因此，有必要进行基因型评价，并挖掘粗脂肪和脂肪酸组分含量关联的关键遗传标记。前人已广泛用SSR标记对胡麻遗传多样性和群体结构进行评价，Cloutier等[9]用30个EST-SSR引物对23份胡麻种质进行了遗传多样性分析。Wu等[10]采用简化基因组测序技术，在胡麻中开发出1574个SSR标记。Choudhary等[11]利用22个SSR标记的270个多态性位点与130份胡麻种质的26个表型性状进行关联分析，获得了 95个显著关联位点。这些结果均说明利用SSR标记对胡麻种质遗传多样性评价及其关联分析具有一定可行性。

本文以230份胡麻种质为研究对象，通过品质相关性状的SSR标记关联分析，获得与目标性状显著关联的SSR位点，为胡麻分子标记辅助选择育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验于2018年在内蒙古自治区农牧业科学院试验田（111°48′ E、40°49′ N）进行，海拔 1056m，年降水量410mm，年日照时数3000h。以230份胡麻核心种质材料为研究对象，其中112份为国内种质，分别来自6个胡麻主产区（内蒙古23份、甘肃42份、河北14份、山西14份、宁夏12份、新疆7份），118份为国外种质，分别来自9个国家（美国21份、荷兰18份、匈牙利18份、加拿大16份、法国12份、巴基斯坦12份、阿根廷7份、伊朗7份、俄罗斯7份）。

1.2 试验设计

采用随机区组设计，重复3次，种植3行，每行种200粒种子，行长1.0m，行距30.0cm。按常规田间管理方法进行管理。出苗后，苗期取 2.00g新鲜嫩叶片于-80℃冰箱保存备用。

1.3 测定项目与方法

待田间植株种子生理成熟后，从试验小区随机取样20株，用DA7200型近红外仪分别测定棕榈酸（palmatic acid，PAL）、硬脂酸（stearic acid，STE）、油酸（oleic acid，OLE）、亚油酸（linoleic acid，LIO）、亚麻酸（linolenic acid，LIN）和粗脂肪（crude fat，CF）等品质性状的含量。

1.4 基因组DNA提取、检测及PCR扩增

取出-80℃保存的样品，用冷冻玻璃棒破碎，参照Stewart等[12]提出的CTAB法提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶和核酸测定仪检测DNA的纯度和浓度。从NCBI下载亚麻全基因组序列信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000224295.2）和亚麻EST-SSR信息，利用MISA和SSR IT软件[13]检测亚麻SSR引物信息。共得到81 369对SSR引物，利用Primer 5.0软件默认参数（碱基序列长度120～300bp，Tm值 57℃～65℃，引物长度 20～25bp）进行引物设计，在设计结果中选择150对SSR引物（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成），从中筛选出30对条带清晰、重复性好的引物（表1），对供试材料进行基因型检测。PCR反应体系为25.0μL（TaqMaster Mix：12.5μL、10μmol/L 引物共 1.0μL、40ng DNA模板3.0μL和超纯水8.5μL）。扩增程序为 94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min，4℃保存。用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物，恒功率 70W 电泳1.5h，采用银染法显色[14]。通过DNA Marker1500，统计DNA差异条带，标记为“0”或“1”。

表1 30对引物序列Table 1 Sequences of 30 pairs of primers

1.5 数据处理

表型数据分析包括最大值、最小值、均值、方差、变异系数和遗传多样性分析。表型变异系数（CV）=标准差/平均值。用Shannon Weaver指数衡量表型性状的遗传多样性。用 SPSS 19.0软件完成胡麻表型性状之间的相关性分析和主成分分析[14]。

参照DNA标准物，记录条带大小和有无情况。在相同迁移位置上有条带记为“1”，无条带记为“0”，组成一个“1”和“0”的数据矩阵[15]。用 PopGene 1.32软件计算有效等位基因数和引物多态性信息含量（PIC）[16]。用NTSYS 2.10软件进行遗传相似性和非加权组平均法（UPGMA）聚类分析[17]。

用Structure 2.3软件分析群体结构，K值设置在 2～10，“Length of burn-in period”设置为 10 000，3次重复。根据K值得出折线图，确定最佳K值[18-19]。

用TASSEL 5.0软件对表型数据和SSR基因型数据进行广义线性模型（general linear model，GLM）关联分析，得出P值、表型变异解释率、关联位点以及表型效应值。

2 结果与分析

2.1 胡麻种质品质性状分析

对230份胡麻种质油脂含量进行统计分析，结果（表2）表明，变异系数为7.39%～22.67%，遗传多样性指数为2.66～2.80，硬脂酸含量的变异系数最高，为22.67%，亚麻酸和粗脂肪含量的遗传多样性指数最大，均为2.80。根据变异系数和遗传多样性指数来判断，230份胡麻种质品质性状变异范围较大，遗传多样性丰富，可用于优异基因资源的挖掘研究。

2.2 胡麻种质品质性状之间的相关性分析

由表3可知，15对品质性状组合中有6对性状间呈极显著正相关，有3对性状间呈极显著负相关，粗脂肪含量与棕榈酸、亚油酸和亚麻酸含量呈极显著正相关，其中与亚麻酸含量的相关系数最大，为 0.669，说明高亚麻酸含量的品种粗脂肪含量也高。亚麻酸含量与棕榈酸含量呈极显著正相关（0.308），与油酸和亚油酸含量呈极显著负相关，该结果与前期对401份胡麻材料的表型分析结果一致[20]。亚油酸含量与硬脂酸含量呈极显著正相关（0.394）。硬脂酸脱氢成为油酸，再脱氢成为亚油酸，因此硬脂酸含量越高亚油酸含量也越高。棕榈酸含量与油酸含量呈极显著正相关（0.360），与硬脂酸含量呈极显著负相关（0.429）。粗脂肪含量与其他4种脂肪酸含量均呈显著正相关，说明不饱和脂肪酸含量与粗脂肪含量密切相关。

表3 胡麻种质品质性状之间的相关性分析Table 3 Correlation analysis of quality characteristics of flax germplasms

2.3 SSR引物多态性分析

筛选出的30对SSR引物在230份胡麻材料中共扩增出365个条带（表4），平均每对引物扩增出12.17个条带，其中Lu291引物扩增的条带最多（18条），多态性位点在 6～18，有效等位基因数在1.2168～1.8320，引物 PIC 为 0.2489～0.6257，其中Lu37引物PIC最高，为0.6257，其次为Lu422引物，为0.6117，引物平均PIC为0.4322。图2为24份亚麻种质Lu840引物的扩增结果。

图2 引物Lu840在24份胡麻种质中的扩增结果Fig.2 Amplification results of primer Lu840 in 24 flax germplasms

表4 30对SSR引物在230份胡麻种质的扩增结果Table 4 Amplification of 230 flax germplasms using 30 pairs of SSR primer

2.4 胡麻种质的群体结构分析

230份胡麻种质的群体结构分析结果（图 3）显示，当K=4时，ΔK出现显著峰值，因此，K=4时，分为4个类群，第1类群和第3类群均为57份材料，第2类群为60份材料，第4类群为56份材料。从图4看，4个类群的少数几个材料掺杂其他颜色外，其他材料颜色基本一致，说明供试材料的部分种质的遗传背景较纯。

图3 ΔK随K值的变化曲线Fig.3 ΔK with the change of K values

图4 230份胡麻种质群体结构分析Fig.4 Analysis of population structure of 230 flax germplasms

2.5 胡麻种质品质性状与SSR多态性位点的关联分析

以Q值为协变量，用GLM进行365个SSR多态性位点和表型数据之间进行关联分析（表5），共发现26个SSR位点与胡麻脂肪酸和粗脂肪含量显著关联（P值≥5.00），其中检测到的亚油酸含量SSR位点最多（8个），硬脂酸和棕榈酸含量的SSR位点均是5个，粗脂肪含量SSR位点4个，亚麻酸含量SSR位点最少（1个）。表型变异解释率在2.45%～3.44%（表5），S342位点对油酸含量表型解释率最高（3.44%）。粗脂肪和亚油酸含量均有S116位点，亚油酸和亚麻酸含量均有S347位点，对这2个位点进一步验证后可以开发实用性分子标记，为胡麻分子标记辅助选择育种中应用提供理论基础。

表5 胡麻种质品质性状与SSR多态性位点的关联分析Table 5 Association analysis of quality characteristic s and SSR polymorphism loci of flax germplasms

3 讨论

胡麻是世界十大油料作物之一，我国内蒙古因其特殊的自然环境，生产的胡麻籽粒饱满，光泽度好，含油率高，独具区域优势[3]。胡麻油脂含量及其遗传多样性评价是胡麻高值化育种的重要途径之一。但由于胡麻脂肪酸含量属多个基因控制的数量性状，传统的数量遗传学研究方法难以对数量性状基因的效应、作用方式以及染色体分布进行准确研究。分子育种实现了直接对目标性状基因型的选择，大幅度提高了育种的选择效率，缩短了育种年限。因而，品质相关性状紧密关联的分子标记筛选研究对胡麻品质遗传改良具有重要意义。

粗脂肪和 5种脂肪酸组分含量的变异系数为7.39%～22.67%，遗传多样性指数为2.66～2.80，粗脂肪含量与亚麻酸、亚油酸、油酸和棕榈酸含量呈显著正相关，说明脂肪酸组分含量的提高可以增加粗脂肪含量，与前期研究[20]结果一致。此结果为胡麻育种亲本选择提供理论依据。为了更好地服务胡麻育种，这些试验结果还需要通过多年多点的大田试验进一步鉴定与评估。

近年来，胡麻 SSR标记开发研究报道[21-22]较多，但这些开发的分子标记应用于胡麻分子育种的寥寥无几，因此，胡麻种业发展需要更多种质资源的表型和基因型鉴定评价，并挖掘实用性分子标记，加快育种进程。作物大多数品质性状属于数量性状，被复杂的基因网络控制，关联分析可以鉴定某一群体内性状与遗传标记或候选基因间的关系，具有同时检测同座位多个等位基因的能力，另外关联分析还具有不需要专门构建作图群体、研究时间较少和精确性较高的优点，应用关联分析方法发掘植物数量性状基因已成为目前国际作物基因组学研究的热点之一[23]。本研究利用30对SSR引物对230份胡麻核心种质进行基因型检测，共扩增出365个条带，与6个品质性状的表型数据进行关联分析，获得了26个显著关联的SSR位点，其中S347位点与亚麻酸和亚油酸含量紧密关联，S116位点与粗脂肪和硬脂酸含量紧密关联。因此S347和S116标记可以通过验证开发实用性标记，在胡麻油脂遗传改良中加以利用。

4 结论

230份胡麻种质粗脂肪和5种脂肪酸组分含量的变异系数为 7.39%～22.67%，遗传多样性指数为2.66～2.80，说明供试材料遗传多样性丰富；筛选出了30对SSR引物，共扩增出365个条带，有效等位基因数在 1.2168～1.8320，引物 PIC 为 0.2489～0.6257；在群体结构K=4时，可将230份胡麻资源材料分为4个类群；检测到5种脂肪酸显著关联的SSR位点22个，检测到粗脂肪SSR位点4个。